高效液相色譜法測(cè)定七葉蓮中延胡索酸的含量

涂 瓊，盧慶紅

（江西省兒童醫(yī)院藥劑科，南昌 330006）

七葉蓮又名七角楓，是五加科大參屬植物，在我國(guó)西南部和長(zhǎng)江中下游的廣大地區(qū)均有分布。七葉蓮全草入藥，有驅(qū)熱散風(fēng)、解毒消腫、散瘀接骨之功效，常用于治療骨折、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、跌打損傷等各種疾病，尤其應(yīng)用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療取得了很好的效果[1]。近幾年，從七葉蓮的揮發(fā)油中分離了倍半萜烯類化合物并證明其具有抗腫瘤作用[2]，在七葉蓮的其他提取物中分離了三萜皂苷類化合物和有機(jī)酸。其有機(jī)酸主要成分之一為延胡索酸[3]，與琥珀酸、γ-羥基丁酸共同配制的三丁酸鈉注射液，熱板法鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)具有顯著鎮(zhèn)痛作用。為有效反映七葉蓮藥材質(zhì)量，筆者參考有關(guān)文獻(xiàn)[4-5]，建立高效液相色譜法測(cè)定七葉蓮藥材中延胡索酸的含量，以期為七葉蓮藥材質(zhì)量提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

LC-10ATvp、島津SPD-10Avp高效液相色譜儀。HHS 21-4B型號(hào)電熱恒溫水浴鍋（上海醫(yī)療機(jī)械五廠），延胡索酸對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：1541-200001），七葉蓮藥材于2008年3月采自江西省宜豐縣山區(qū)，由江西中醫(yī)學(xué)院中藥鑒定室賴學(xué)文副教授鑒定為五加科大參屬植物短梗大M.rosthornii，并粉碎成細(xì)粉備用。乙腈為色譜純，水為重蒸餾水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸溶液（5∶95）；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm，流速 1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量 5 μL；柱溫：35 ℃。在上述色譜條件下，供試品溶液中延胡索酸與其他成分能達(dá)到基線分離，與相鄰色譜峰的分離度大于1.5，見圖 1。

圖1 高效液相色譜圖

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取延胡索酸對(duì)照品適量，加甲醇溶解制成每毫升含1.024 mg的延胡索酸溶液，作對(duì)照品儲(chǔ)備液，備用。

2.2.2 供試品溶液的制備

取本品粉末（過(guò) 1號(hào)篩）約2 g，精密稱定，加70%乙醇200 mL回流提取2 h，提取液濾過(guò)，至水浴蒸干，殘?jiān)邮兔?0 mL浸泡2次，每次5 min，棄去石油醚液，蒸干，殘?jiān)眉状既芙猓浦?0 mL量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，作為供試品溶液。

2.3 線性關(guān)系考察

精密量取延胡索酸對(duì)照品溶液 0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、2、3 mL，置 5 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。精密吸取5 μL，注入液相色譜儀中，測(cè)定延胡索酸峰面積。以進(jìn)樣量（C）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程：Y=24 365C-272.104，r=0.999 5。結(jié)果顯示，延胡索酸的檢測(cè)濃度在0.102 4～3.067 2 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4 精密度試驗(yàn)

取濃度為0.102 4 mg·mL-1的延胡索酸對(duì)照品溶液，精密吸取5 μL，在上述色譜條件下,連續(xù)測(cè)定5次，結(jié)果測(cè)得延胡索酸峰面積分別為226 770、216 549、218 967、223 675、221 250，RSD 為 1.79%，表明精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，精密吸取供試品溶液5 μL，在 0、2、4、6、8 h 分別按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果測(cè)得延胡索酸峰面積分別為95 112、95 526、95 091、95 040、95 707，平均峰面積 95 295，RSD 為0.32%，表明樣品在8 h內(nèi)穩(wěn)定，本方法穩(wěn)定性良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一七葉蓮藥材5份，按“2.2.2”項(xiàng)中方法制備樣品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，并計(jì)算含量。結(jié)果5份樣品延胡索酸含量的RSD為0.61，符合重復(fù)性要求。

2.7 加樣回收試驗(yàn)

取已知延胡索酸含量的七葉蓮藥材1 g，9份，精密稱定。各樣品分別加入延胡索酸對(duì)照品貯備液適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。結(jié)果延胡索酸的平均回收率為99.05%，RSD為0.55%。結(jié)果見表1。

表1 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.8 樣品測(cè)定

取七葉蓮5批樣品，經(jīng)干燥、粉碎后分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，精密吸取延胡索酸對(duì)照品溶液和供試品溶液各 5 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算延胡索酸的含量。結(jié)果顯示，5批樣品中延胡索酸含量分別為0.480%、0.485%、0.478%、0.493%、0.465%。

3 討論

1）波長(zhǎng)的選擇:將適量濃度的延胡索酸對(duì)照品溶液用紫外分光光度儀在波長(zhǎng)200～400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，結(jié)果延胡索酸在210 nm處有最大吸收。

2）提取溶劑的選擇:曾用 95%、80%、70%、60%乙醇作為溶劑進(jìn)行提取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)70%乙醇提取效果相對(duì)較高，故選用70%乙醇作為提取溶劑。

3）流動(dòng)相的選擇：曾用甲醇-0.01 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液（5∶95）、甲醇-0.01 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液（10∶90）、乙腈-0.4% 磷酸二氫鉀（20∶80）、乙腈-0.1%磷酸溶液（5∶95）作為溶劑系統(tǒng)。結(jié)果表明，乙腈-0.1%磷酸溶液（5∶95）系統(tǒng)的分離效果最好。

采用HPLC法測(cè)定七葉蓮藥材中的延胡索酸含量，簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、精密度好，平均加樣回收率為99.05%，為更好地控制七葉蓮藥材的質(zhì)量提供了可靠的方法。

[1] 周菲菲，朱湘生.七葉蓮酒治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎臨床觀察[J].中國(guó)農(nóng)村醫(yī)學(xué)，1998，6（5）：44.

[2] 何濤，李林松，康麗潔，等.七葉蓮揮發(fā)油成分的GC/MS分析[J].江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2006，18（4）:51.

[3] 崔向青，蔣燕，楊輝.七葉蓮的研究進(jìn)展[J].中華中醫(yī)學(xué)雜志，2005，20（增刊）：308-309.

[4] 廖建春.高效液相色譜法測(cè)定七葉蓮膠囊中延胡索酸的含量[J].藥學(xué)與臨床研究，2007,15（5）:421-422.

[5] 劉佳，樸惠順，施溯筠，等.HPLC法測(cè)定金頂側(cè)耳中延胡索酸的含量[J].中國(guó)藥房，2010,21（11）:1018-1019.