不同發(fā)育階段胎兒表皮干細胞差異表達基因的研究

藍 蔚 ，彭 燕 ，劉德伍 ，紀雪亮 ，易先鋒

（1.廣東省工傷康復醫(yī)院燒傷整形科，廣州 510440；2.南昌大學第一附屬醫(yī)院燒傷中心，南昌 330006）

表皮干細胞是來源于胚胎外胚層皮膚組織的專能干細胞，是皮膚及其附屬器發(fā)生、修復、改建的源泉。表皮干細胞的增殖分化機制十分復雜，受整合素、信號轉導通路及細胞因子等眾多因素的影響[1]。目前，對人表皮干細胞一些單個基因如P63、c-myc、K19等的表達特點及其影響因素研究已取得了一定的進展，已知它們在人體不同年齡階段的表達存在差異[2-3]，但對人胎兒表皮干細胞基因的表達特點及其變化規(guī)律還不清楚。本研究采用基因芯片技術篩選早期胎兒與晚期胎兒表皮干細胞差異表達基因，從整體初步分析2個不同發(fā)育階段人表皮干細胞基因表達變化的特征及其可能的生物學意義，為進一步尋找特異性發(fā)育調控基因提供線索，為表皮干細胞增殖分化特性的研究及其應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 標本來源

胎齡4～12周胎兒皮膚標本 （早期胎兒組）及28～32周胎兒皮膚標本（晚期胎兒組），來源于正常發(fā)育人工終止妊娠胎兒，由廣東省工傷康復醫(yī)院婦產科提供。每組10例。標本采集均得到患兒及家屬知情同意，研究方案經醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。

1.2 表皮干細胞的分離培養(yǎng)

2組均采用胰蛋白酶和EDTA聯(lián)合消化法分離表皮，用Ⅳ型膠原快速黏附法分離、純化胎兒表皮干細胞，以含表皮生長因子、角質細胞無血清培養(yǎng)液等組成胎兒表皮干細胞培養(yǎng)基進行體外培養(yǎng)[4]。每組10例細胞分離純化后混合培養(yǎng)。

1.3 表達譜芯片的制備

芯片由北京博奧生物芯片有限公司提供，為人基因組寡核苷酸芯片（22 K），共有21 522條70 mer長度的Oligo DNA（每條Oligo DNA代表了人的一個基因），人類基因的Oligo庫來自于Operon公司的 Human Genome Oligo Set Version 2.1。將此Oligo庫用SmartArrayer點樣儀點制在一張75 mm×25 mm經過化學修飾的載玻片上。為質控芯片制備和雜交的整個過程，點制在芯片上的樣品還包括人的4個看家基因（H-ACTB、H-GAPD、H-LDHA、H-RPL9）作為陽性對照，以檢測芯片數據的波動性。12條人工合成的與人基因沒有同源性的70 mer Oligo DNA以及DNA點樣液作為陰性對照。用來自酵母的8個與實驗樣品無關的核酸序列作為外參，Hex作為點樣陽性對照，以避免受到實驗RNA樣品的干擾，檢查芯片系統(tǒng)的有效性。

1.4 表皮干細胞RNA的提取

Trizol（Invitrogen,Gaithersburg,MD,USA）一步法提取細胞中的總RNA，通過異丙醇沉淀法濃縮RNA，并進一步采用NucleoSpin RNA clean-up試劑盒（MACHEREY-NAGEL，Germany）對總 RNA 進行過柱純化，最后用分光光度計定量，甲醛變性膠電泳質檢。

1.5 細胞RNA的熒光標記

以Total RNA起始，含有T7啟動子序列的T7 Oligo（dT）Primer為引物，使用 CbcScript酶進行反轉錄合成cDNA。反轉錄產物用PCR NucleoSpinExtractⅡ Kit（MN）純化。以 Random Primer為引物對反轉錄cDNA進行KLENOW酶標記，分別用Cy3-dCTP、Cy5-dCTP（GE Healthcare Cat.No.PA 55021/PA53021）標記Human對照組（以人類基因作為共同參照）和早期胎兒組，晚期胎兒組，標記產物用PCR NucleoSpinExtractⅡ Kit（MN）純化，純化后抽干。

1.6 雜交與清洗

標記的 DNA 溶于 80 μL雜交液中（3×SSC，0.2%SDS,5×Denhart’s,25%甲酰胺），于 42 ℃雜交過夜。雜交結束后，先在42℃左右含0.2%SDS，2×SSC的液體中洗 5 min，而后在0.2×SSC中室溫洗5 min。玻片甩干后即可用于掃描。

1.7 芯片圖像的采集與數據分析

芯片用LuxScan 10 KA雙通道激光掃描儀（CapitalBio公司）進行掃描。采用LuxScan 3.0圖像分析軟件（CapitalBio公司）對芯片圖像進行分析，把圖像信號轉化為數字信號；對芯片上的數據用Lowess方法進行歸一化。根據cy5和cy3總體信號的平均值對各芯片進行片間線性校正，使得各張芯片的平均值相同；根據信號強度和圖像質量對基因進行標記。判定基因有差異表達的標準為：表達差異值（Ratio值）=Cy5/Cy3比值＞2或＜0.5。

2 結果

2.1 表皮干細胞生物學特性觀察

倒置相差顯微鏡下觀察，體外培養(yǎng)的早期胎兒與晚期胎兒表皮干細胞形態(tài)相似，細胞克隆形成速度與克隆集落無明顯差異。

2.2 總RNA抽提結果

提取的表皮干細胞總RNA在吸光度A260/280值≥1.8，甲醛變性凝膠電泳顯示28 S、18 S條帶亮度清晰、完整，質量合格，符合實驗要求。

2.3 基因芯片掃描結果

在芯片操作過程中，Hex、外標、內標等陽性對照信號正常，陰性對照檢測為陰性；看家基因重復性好，Ratio值CV不超過0.3，無影響數據的污染，從一方面證實實驗數據的可靠性。晚期胎兒組與早期胎兒組樣本相比，差異表達基因有805個，其中上調的基因有416個，下調的基因有389個。

2.4 差異基因表達分析

對結果在Molecule Annotation System進行了Pathway和Go的統(tǒng)計分析，差異基因涉及蛋白質翻譯、能量合成和DNA復制，根據其表達蛋白的功能可將它們分為如下幾類：1）核苷酸結合蛋白基因；2）蛋白質折疊結合相關基因；3）鋅離子結合蛋白基因；4）ATP 結合蛋白基因；5）GTP 結合蛋白基因；6）序列特異性DNA結合蛋白基因；7）促分裂原活化蛋白激酶基因；8）核仁蛋白家族基因；9）癌基因與抑癌基因 ；10）核小體裝配基因；11）其他類型基因。分子注釋系統(tǒng)對差異表達基因的部分分類見表1。

晚期胎兒組與早期胎兒組相比，表達上調的基因主要為核苷酸結合蛋白基因、蛋白質折疊結合相關基因、鋅離子結合蛋白基因和ATP結合蛋白基因等；表達下調的基因主要為GTP結合蛋白基因、序列特異性DNA結合蛋白基因、促分裂原活化蛋白激酶基因和核仁蛋白家族基因等。

表1 最顯著差異表達基因的部分分類

3 討論

在人體不同發(fā)育階段，皮膚對于創(chuàng)傷的修復能力不同。在胎兒時期，人們可以觀察到胎兒傷口的“無瘢痕愈合”。而表皮干細胞作為皮膚組織的專能干細胞，在皮膚發(fā)育成長過程中起著決定性的作用。目前對表皮干細胞一些單個基因的表達特點及其影響因素的研究已取得了一定的進展，但對人體生長發(fā)育過程中表皮干細胞的整體基因表達特點及其變化規(guī)律還不清楚。因此研究不同發(fā)育階段人表皮干細胞基因表達譜的變化，對進一步探討表皮干細胞的增殖分化機制、發(fā)展規(guī)律及其影響因素具有重要意義。

基因芯片是分子生物學實驗技術的一個新突破，利用該技術可以對成千上萬個基因的表達進行平行分析[5-7]。其基本原理是核酸分子雜交,即通過把大量的DNA片段以可尋址的方式,高密度地固定到一小塊載玻片上,利用核酸堿基之間的配對,以大量已知序列的寡核苷酸、cDNA或基因片段作探針,對樣品DNA進行高效、并行的分析。基因芯片技術的突出特點是集成化、微型化及自動化，代表了未來分子診斷的發(fā)展趨勢[8-10]。本研究采用基因芯片技術篩選早期胎兒與晚期胎兒表皮干細胞差異表達基因，通過分析二者之間基因表達的差異信息，來探索表皮干細胞的發(fā)育和增殖分化規(guī)律。研究結果顯示：晚期胎兒與早期胎兒比較，胎兒表皮干細胞差異表達基因有805個，表明隨著人的生長發(fā)育，表皮干細胞的基因表達發(fā)生了較大的改變，其在人胚胎發(fā)育不同時期所處的狀態(tài)受到多種基因的表達調控。研究還發(fā)現(xiàn)，晚期胎兒與早期胎兒相比較表達上調的基因416個，主要有以下幾類：1）核苷酸結合蛋白基因，如DYNC1H1，PRKCI。DYNC1H1屬于動力蛋白，它參與微管為基礎的運動及有絲分裂紡錘體組織和生物發(fā)生。PRKCI[11]為蛋白激酶 Ci，它參與蛋白定向膜、細胞骨架組織和生物發(fā)生，以及確立和（或）維持表皮細胞極性及細胞間連接組裝和維持。2）蛋白質折疊結合相關基因，如HSPE1。HSPE1參與蛋白質的折疊與伸展及多聚復合體的組裝。3）鋅離子結合蛋白基因。4）ATP結合蛋白基因。上調基因主要為細胞骨架結構蛋白基因。細胞骨架[12]是指真核細胞中的蛋白纖維網架體系。細胞骨架不僅在維持細胞形態(tài)和保持細胞內部結構的有序性中起著重要作用，而且與細胞的胞質運動、物質運輸、能量轉換、信息傳遞、基因表達、分裂和分化等生命活動密切相關。晚期胎兒組與早期胎兒組比較，表達下調的基因389個，主要有以下幾類：1）GTP結合蛋白基因，如EFTUD2，為含延伸因子Tu GTP結合域2，它參與核mRNA剪接、蛋白生物合成及RNA剪接。2）序列特異性DNA結合蛋白基因，如FOSL2，ELF4。FOSL2屬于轉錄因子AP-1家族，它對細胞因子、生長因子、感染或致癌刺激等生理或病理信號發(fā)生應答，調節(jié)基因的轉錄，參與細胞的增殖、分化等過程。ELF4為E74樣因子4，它參與細胞增殖，正調控轉錄自RNA聚合酶Ⅱ啟動子，調控轉錄[13]。 3）促分裂原活化蛋白激酶基因（MAPK），MAPK3、MAPK13、DUSP1 和 DUSP2。 DUSP1[14]和DUSP2參與蛋白氨基酸去磷酸化，抑制MAPK，促使細胞分化。MAPK3[15]和 MAPK13參與調控細胞周期及蛋白氨基酸磷酸化。4）核仁蛋白家族基因，NOLA2和NOLC1均參與rRNA加工，調控細胞周期和有絲分裂。表達下調的基因主要集中在與細胞增殖分化相關的功能基因。

通過本實驗結果分析，晚期胎兒相對于早期胎兒表皮干細胞，一些與細胞成熟相關的細胞骨架結構蛋白基因上調，而如GTP結合蛋白基因、序列特異性DNA結合蛋白基因、MAKP活性蛋白基因等一些與細胞增殖分化相關基因下調。表明，隨著胚胎的發(fā)育，表皮干細胞在維持細胞形態(tài)和保持細胞內部結構特性以及細胞穩(wěn)態(tài)的維持上更加成熟，而其增殖分化的能力可能呈現(xiàn)下降趨勢。另從本實驗結果看,基因表達譜的變化與臨床上關于創(chuàng)傷修復的研究結論有較好一致性，說明所采用的基因芯片技術是可靠的。通過對這一同種基因縱向的比較，篩選差異表達基因，及在分子水平對相關基因群的進一步研究，有助于使研究者獲得對表皮干細胞的新認識和新結論。

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