病死豬肉快速檢測(cè)試紙研究

朱珍珍，賈杏林，李曉云，聶 培，黃 林，吳昌奇

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410128）

隨著畜牧業(yè)的快速發(fā)展和工業(yè)化進(jìn)程的加快，疫病種類(lèi)不斷增加，社會(huì)上私自屠宰病死豬，病死豬肉逃避檢疫進(jìn)入市場(chǎng)的情況時(shí)常發(fā)生[1-3]。同時(shí)，隨著人們生活質(zhì)量的提高和消費(fèi)保健意識(shí)的不斷增強(qiáng)，人們對(duì)肉品質(zhì)量要求越來(lái)越高，因而對(duì)病死豬肉的檢測(cè)越來(lái)越受到關(guān)注。目前檢驗(yàn)病死豬肉的方法主要為肉眼觀察和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)[4-5]。肉眼觀察需要豐富的經(jīng)驗(yàn)，主觀性強(qiáng)，因此常出現(xiàn)病死豬肉漏檢的現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)室主要檢測(cè)方法有硫酸銅肉浸液法、過(guò)氧化物酶試劑法、PH試紙法，這些方法繁瑣，難以滿足當(dāng)前市場(chǎng)病死豬肉現(xiàn)場(chǎng)快速大范圍檢疫的需要。因而，急需一種快速、簡(jiǎn)便、靈敏、高效的試紙檢測(cè)方法來(lái)識(shí)別病死豬肉。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 肉樣來(lái)源 湖南省16個(gè)豬場(chǎng)送檢病死豬臨床樣53份。市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)豬肉130份，其中包括長(zhǎng)沙市某超市30份，某品牌豬肉40份，集貿(mào)市場(chǎng)60份。將所有肉樣置于-20 ℃的冰柜中冷凍保存。

1.1.2 豬肉肉浸液的提取 取豬肉50 g，除去脂肪和結(jié)締組織，剪碎研勻，置容器中，加3倍肉樣量的蒸餾水，玻璃棒不時(shí)攪拌，浸漬10 min用濾紙過(guò)濾，濾液置4 ℃冰箱備用。

1.1.3 試劑 5%～10%硫酸銅溶液；PH5.4-7.0精密試紙條；TMB（北京索萊寶生物科技有限公司），用無(wú)水乙醇配制成2.0 g/L原液；過(guò)氧化脲（Sigma，204-701-4）1.0 g，用蒸餾水配制10 g/L原液；蒸餾水。

1.1.4 器材及設(shè)備：剪刀；鑷子；試管；小滴管；電子天平；微型絞肉機(jī)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 TMB過(guò)氧化物酶試紙法

TMB與過(guò)氧化脲以1:5的濃度比例分別用定性濾紙浸泡，37 ℃烘干。將TMB試紙條與過(guò)氧化脲試紙條疊放在一起，處理后的肉浸液滴于試紙上，3～5 min后觀察結(jié)果。試紙呈為藍(lán)色判為健康肉，試紙顏色無(wú)變化為病死豬肉。

1.2.2 硫酸銅肉浸液法[5]

向試管中分別加被檢肉樣和健康肉樣的肉浸液2 mL，再分別滴加3～5滴5%～10%硫酸銅溶液，5～10 min判斷結(jié)果。健康新鮮豬肉，溶液澄清透明，無(wú)絮片狀或顆粒狀凝聚物。病死豬肉，溶液中出現(xiàn)明顯渾濁、絮片狀、顆粒狀凝聚物或呈膠凍狀。

1.2.3 PH試紙法[5-6]

取肉浸液滴于PH5.4-7.0精密試紙條一端，數(shù)秒后與標(biāo)準(zhǔn)比色板比較，幾秒鐘后可出結(jié)果。病死豬肉，PH>6.5，健康豬肉通常在5.8-6.5之間。

1.2.4 過(guò)氧化物酶試劑法[6]

取2 mL肉浸液注入試管內(nèi)，加入3滴1%過(guò)氧化氫溶液，再加入3滴0.2%的TMB溶液，混勻溶液，3～5 min內(nèi)觀察溶液顏色變化。健康豬肉，肉浸液出現(xiàn)藍(lán)色或藍(lán)綠色變化。病死豬肉肉浸液不出現(xiàn)上述變化，或1～3 min后出現(xiàn)淡青色。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

本文用上述四種方法分別對(duì)53份死豬肉和130份市場(chǎng)肉樣進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。從表1可知，這四種方法對(duì)病死豬肉樣品的檢測(cè)符合率均在90%以上，但是TMB過(guò)氧化物酶試紙法以及試劑法對(duì)病死豬肉的檢測(cè)符合率、市場(chǎng)未知樣品的檢出率都高于硫酸銅肉浸液和PH試紙法。

表 1 四種快速檢測(cè)方法結(jié)果統(tǒng)計(jì)（符合率）

3 討論

國(guó)內(nèi)對(duì)鑒別病死豬肉方法的研究只是將TMB檢測(cè)法與其它檢測(cè)法對(duì)比，并在小范圍內(nèi)調(diào)整TMB濃度和過(guò)氧化脲濃度[7]。而本實(shí)驗(yàn)對(duì)過(guò)氧化脲的濃度做了大范圍呈線性的變化調(diào)整，并且通過(guò)對(duì)TMB和過(guò)氧化脲濃度的梯形設(shè)計(jì)試驗(yàn)，篩選兩者不同的濃度比例，初步得出檢測(cè)率最高的TMB和過(guò)氧化脲的濃度比例為1:5。同時(shí)，對(duì)試紙條材質(zhì)的以及干燥方法進(jìn)行篩選，確定最適反應(yīng)條件，后期還進(jìn)行了試紙的保質(zhì)期試驗(yàn)，采用多種方法對(duì)檢測(cè)試紙進(jìn)行保存，定期檢測(cè)試紙的靈敏度。

該試紙對(duì)健康豬肉和臨床實(shí)驗(yàn)豬肉、市場(chǎng)送檢未知豬肉樣進(jìn)行檢測(cè)，擴(kuò)大了樣品的范圍，驗(yàn)證了試紙對(duì)豬肉檢測(cè)的普遍適用性。并且，從實(shí)驗(yàn)過(guò)程可知，硫酸銅肉浸法實(shí)驗(yàn)過(guò)程繁瑣；PH試紙法靈敏度低，只有在豬肉腐敗的情況下才能檢測(cè)，易受光線、環(huán)境、人員差異等外界因素影響；TMB過(guò)氧化物酶試劑法的檢測(cè)試劑不易保存，操作不便。本實(shí)驗(yàn)研究的試紙是針對(duì)任何時(shí)期的豬肉檢測(cè)都可行，并且經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明符合率高，操作及攜帶簡(jiǎn)便，成本低廉、環(huán)保無(wú)毒，且保存期可達(dá)到半年以上，適合市場(chǎng)上檢疫工作人員大批量大范圍的初查。相比于目前常用的的病死豬肉的檢測(cè)方法，不論是從檢測(cè)的范圍性以及靈敏度來(lái)說(shuō)，該試紙都具有明顯的優(yōu)勢(shì)。

最后，試紙中TMB和過(guò)氧化脲的濃度比例，所選擇試紙的材質(zhì)均有可能影響試紙檢測(cè)的靈敏度，為了避免病死豬肉漏檢現(xiàn)象，必須輔以感官檢測(cè)、微生物檢驗(yàn)和其他理化檢驗(yàn)方法進(jìn)行綜合判斷。

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