36株多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌對氨基糖苷類藥物耐藥基因的流行病學(xué)研究

邢麗丹，糜祖煌，徐鑫鑫，汪 汀，田莎莎，原鴻雁，張 盼，紀(jì)曉昀，蘇兆亮，許化溪

2.江蘇省無錫市克隆遺傳技術(shù)研究所。

鮑曼不動(dòng)桿菌是一類醫(yī)院常見的不發(fā)酵糖革蘭陰性桿菌，屬條件致病菌。在人類，鮑曼不動(dòng)桿菌可定植于皮膚、傷口、呼吸道和消化道，在免疫力低下時(shí)可感染機(jī)體發(fā)?。?］。近年來由于抗菌藥物的大量使用和各種侵襲性診療操作的實(shí)施，鮑曼不動(dòng)桿菌的檢出率和耐藥率越來越高，甚至在一些科室呈暴發(fā)流行，引起了臨床和實(shí)驗(yàn)室醫(yī)師的廣泛關(guān)注。鮑曼不動(dòng)桿菌具有自動(dòng)上調(diào)或主動(dòng)獲得耐藥決定因子的能力［2］，其耐藥性正在逐年的增高，而且臨床感染多以多重耐藥菌株為主，對臨床治療帶來了極大的困難和挑戰(zhàn)。對于感染鮑曼不動(dòng)桿菌患者的治療通常采用β內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類和氟喹諾酮類抗菌藥物，但隨著這些抗菌藥物使用的增加，耐藥菌株越來越多。為了解本地區(qū)鮑曼不動(dòng)桿菌的流行和耐藥情況，本研究對江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院和鎮(zhèn)江市第一人民醫(yī)院于2012年8—11月分離的多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的氨基糖苷類耐藥基因aac（3）－I、aac（6’）－Ib、aph（3’）和16S rRNA甲基化酶基因armA 進(jìn)行了檢測，旨在為臨床氨基糖苷類抗生素的合理應(yīng)用提供參考。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

材料與方法

一、材料

臨床分離的36株鮑曼不動(dòng)桿菌均來自2012年8—11月江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院和鎮(zhèn)江市第一人民醫(yī)院36例住院患者的臨床樣本，剔除同一患者同一部位重復(fù)分離的菌株?；颊吣?6例，女10例，年齡9～93歲。樣本分布為：痰液34份，靜脈置管1份，腹水1份。

二、方法

（一）藥物敏感試驗(yàn) 采用K－B紙片擴(kuò)散法測定多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌對抗菌藥物的敏感性，MH瓊脂和藥敏紙片分別為博賽生物科技有限公司和OXOID公司產(chǎn)品，以大腸埃希菌ATCC 25922和銅綠假單胞菌ATCC27853作為質(zhì)控菌株，并根據(jù)2010年版CLSL標(biāo)準(zhǔn)判斷藥敏試驗(yàn)結(jié)果。

（二）細(xì)菌處理 挑選純培養(yǎng)菌落置入0.5 mL離心管內(nèi)（內(nèi)置50μL裂解液和蛋白酶K的混合物），PCR儀上55℃1 h（消化細(xì)菌菌體）后95℃10 min（破壞裂解液內(nèi)的蛋白酶K），然后每管補(bǔ)充200μL純水，即為DNA模板液，置于－20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

（三）基因檢測 PCR法檢測氨基糖苷類耐藥基因，靶基因引物序列見表1。

PCR擴(kuò)增體系為：每反應(yīng)體系P1、P2引物各0.5μmol／L，dNTPs各200 mmol／L，KCl 10 mmol／L，（NH4）2SO48 mmol／L，MgCl22 mmol／L，Tris－HCl（pH9.0）10 mmol／L，NP400.5%，BSA0.02%，Taq DNA pol 1 u?？偡磻?yīng)體積20μL（其中模板液5μL）。PCR擴(kuò)增熱循環(huán)參數(shù)為：93℃預(yù)變性2 min，然后93℃60 s→55℃60 s→72℃60 s，循環(huán)35個(gè)周期，最后72℃延長2 min。耐藥基因檢測試劑盒、靶基因PCR引物序列和陽性對照DNA由無錫市克隆遺傳技術(shù)研究所提供。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳后，在紫外凝膠電泳成像儀下觀察，并記錄結(jié)果。

（四）基因測序 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司提供的ABI3730型毛細(xì)管全自動(dòng)測序儀上測序，委托上海翰宇生物技術(shù)有限公司完成。

（五）序列比對分析 應(yīng)用Chromas讀序工具軟件，測序結(jié)果用Chromas直接作BLAST（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／BLAST ）比對。

表1 靶基因PCR引物序列及終產(chǎn)物長度Table 1 Target genes and the primers used in PCR assay

結(jié) 果

一、藥物敏感試驗(yàn)

多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌是指對5類抗菌藥物中的3類及以上耐藥，包括氨基糖苷類、β內(nèi)酰胺酶抑制劑、頭孢菌素類、碳青霉烯類和氟喹諾酮類抗菌藥物。36株多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果見表2。

二、氨基糖苷類修飾酶基因檢測

氨基糖苷類乙酰轉(zhuǎn)移酶（acetyltransferase）基因aac （3）－1、aac （6′）－1b、磷酸轉(zhuǎn)移酶（phosphotransferase）基因aph（3′）－1和16S rRNA 甲基化酶（16S rRNA methylase）基因armA 均有不同程度的檢出，aph（3′）－1和armA 陽性率較高。氨基糖苷類修飾酶基因檢測結(jié)果見表3。

表2 36株多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果［n（%）］Table 2 Results of susceptibility testing of the 36 multidrug－resistant strains of Acinetobacter baumannii［n （%）］

表3 36株多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌氨基糖苷類耐藥基因結(jié)果［n（%）］Table 3 The prevalence of aminoglycoside－resistant genes in the 36 multidrug－resistant strains of Acinetobacter baumannii［n （%）］

對4種基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DNA測序，并進(jìn)行BLASTn比對分析，結(jié)果與GenBank中已注冊的序列一致，同源性均≥99.0%。

討 論

鮑曼不動(dòng)桿菌是典型的條件致病菌，在醫(yī)院特別是ICU常呈暴發(fā)流行［3］。鮑曼不動(dòng)桿菌感染主要發(fā)生在免疫力低下的患者。常見的危險(xiǎn)因素有長期住院尤其為長期入住ICU、多器官損害、中心靜脈或動(dòng)脈置管的使用、導(dǎo)尿管的使用、輔助通氣、血液透析、急癥腹部手術(shù)、腸道定植、胃造口術(shù)或空腸造口術(shù)管的使用和先前使用過任何抗菌藥物等［1］。隨著鮑曼不動(dòng)桿菌感染患者的增多，抗菌藥物的應(yīng)用進(jìn)一步導(dǎo)致了多重耐藥甚至泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的出現(xiàn)。細(xì)菌對抗菌藥物的耐藥主要是由于耐藥基因表達(dá)的各類水解酶。目前用于治療鮑曼不動(dòng)桿菌的主要抗菌藥物有5類，包括頭孢菌素類（頭孢他啶和頭孢吡肟等），碳青霉烯類（亞胺培南和美羅培南），酶抑制劑復(fù)方（哌拉西林－他唑巴坦），氟喹諾酮類（環(huán)丙沙星和左氧氟沙星）和氨基糖苷類（慶大霉素和阿米卡星）。多重耐藥甚至泛耐藥菌株的出現(xiàn)提示了菌株耐藥機(jī)制的多樣性。諸多文獻(xiàn)報(bào)道了鮑曼不動(dòng)桿菌的不同耐藥機(jī)制。外排泵基因的表達(dá)在多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌中發(fā)揮重要的作用［4］。外排泵的5類超家族在鮑曼不動(dòng)桿菌中最流行的是能夠外排很多抗菌藥物的RND泵的過表達(dá)，主要是AdeABC基因的過表達(dá)［4］，鮑曼不動(dòng)桿菌Ade C能泵出的藥物包括β內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、紅霉素、氯霉素、四環(huán)素類、氟喹諾酮類、甲氧芐啶和溴乙啶［5］。插入序列ISAbal的發(fā)現(xiàn)使碳青霉烯類、頭孢菌素類等耐藥基因高表達(dá)而導(dǎo)致鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥［3，6］。

氨基糖苷類抗生素對不發(fā)酵糖革蘭陰性桿菌、腸桿菌科及一些革蘭陽性球菌均有很好的抗菌活性，與β內(nèi)酰胺類抗生素聯(lián)用有協(xié)同抗菌作用，在感染治療中占有重要地位。氨基糖苷類抗生素是通過抑制蛋白與16S rRNA合成和破壞細(xì)菌細(xì)胞膜的完整性的氨基環(huán)多醇?xì)⑺兰?xì)菌［7］，其中主要耐藥機(jī)制是產(chǎn)生氨基糖苷類修飾酶［8－9］。氨基糖苷類修飾酶主要包括3類作用機(jī)制各不相同的酶：乙酰轉(zhuǎn)移酶修飾依賴于乙酰輔酶A的N－乙?；?，磷酸轉(zhuǎn)移酶修飾依賴于ATP的O－磷酸化，核苷酸轉(zhuǎn)移酶修飾依賴于ATP的腺苷化，降低了它們對核糖體亞單位的親和力［8，10］。氨基糖苷類修飾酶經(jīng)常在流動(dòng)元素中編碼，如質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子和整合子，它們大都隱藏在不分類的額外的耐藥決定簇如ESBLs和MBLs中［8，10］。在鮑曼不動(dòng)桿菌中，所有主要的氨基糖苷類修飾酶都有報(bào)道，用I類整合子編碼氨基糖苷類修飾酶的基因的存在在多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌中非常流行［11－12］。最近的研究報(bào)道了鮑曼不動(dòng)桿菌中質(zhì)粒介導(dǎo)的16S rRNA甲基化作用，這種機(jī)制可以使鮑曼不動(dòng)桿菌對所有的氨基糖苷類抗生素耐藥［13］。氨基糖苷類抗生素通過作用于細(xì)菌核糖體30S亞基的16S rRNA高度保守的A位點(diǎn)，干擾細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成，從而引起細(xì)菌死亡，而質(zhì)粒介導(dǎo)的16S rRNA甲基化酶能夠保護(hù)細(xì)菌的30S核糖體的16S rRNA不與氨基糖苷類藥物結(jié)合，造成對氨基糖苷類藥物的高水平耐藥。

多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌醫(yī)院感染患者常有基礎(chǔ)疾病，或曾接受廣譜抗生素治療。本研究36株多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌大部分來自ICU，其次有呼吸內(nèi)科、老年科等。藥敏試驗(yàn)結(jié)果反映了本組多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥情況相當(dāng)嚴(yán)重，對亞胺培南、頭孢吡肟、頭孢他啶和頭孢曲松的耐藥率均在94.0%以上，對頭孢哌酮－舒巴坦的耐藥率相對較低（16.7%），可能是因?yàn)轭^孢哌酮和舒巴坦聯(lián)合使用，舒巴坦抑制了β內(nèi)酰胺酶對頭孢哌酮的破壞，增強(qiáng)頭孢哌酮的抗菌活性，而對慶大霉素的高耐藥率與氨基糖苷類耐藥基因有關(guān)［1］。armA為16S rRNA甲基化酶，有報(bào)道表明鮑曼不動(dòng)桿菌的雙圈耐藥現(xiàn)象與armA基因誘導(dǎo)型表達(dá)有關(guān)［14］。氨基糖苷類耐藥基因在安徽合肥、浙江寧波、上海、山東泰安、天津、湖南岳陽、江西南昌等很多地區(qū)的鮑曼不動(dòng)桿菌中廣泛存在［14－20］，與鮑曼不動(dòng)桿菌對氨基糖苷類酶的耐藥關(guān)系密切。本研究在一定程度上反映了鎮(zhèn)江地區(qū)鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥情況比較嚴(yán)重，多重耐藥甚至泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的出現(xiàn)提示該菌將是感染治療中的重點(diǎn)和難點(diǎn)。因此，合理使用抗菌藥物是控制耐藥菌醫(yī)院感染的重要手段，也是目前醫(yī)院感染研究的重要課題。

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