姜國良 于 曉 徐 愷 劉 云
(中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院,山東 青島 266003)
目前,人類衰老方面的研究,多采用建立衰老動物模型的方法。衰老動物模型分為自發(fā)性衰老動物模型和實驗性衰老動物模型。實驗性與自發(fā)性相比可控性強(qiáng),易于回溯,縮短建模時間降低建模成本,優(yōu)化實驗流程。目前,可以利用3種方法構(gòu)建衰老動物模型,其中 D-半乳糖注射法最常用〔1,2〕。D-半乳糖是一種衰老誘導(dǎo)劑。它是一種由六個碳和一個醛組成的單糖,歸類為醛糖和己糖。D-半乳糖誘導(dǎo)建立衰老動物模型多采取腹腔和皮下注射D-半乳糖兩種方法。但是對兩種注射方法所建立的衰老動物相關(guān)指標(biāo)的差異一直未見報道〔3〕。本實驗分別采用皮下和腹腔注射D-半乳糖兩種方法構(gòu)建衰老動物模型,通過胸腺和脾臟指數(shù)、血液及組織生化指標(biāo)檢測、組織切片觀察討論兩種模型間的差異,為實驗動物模型建立的標(biāo)準(zhǔn)化提供參考。
1.1 實驗試劑 D-半乳糖(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司),葡萄糖測定試劑盒,C反應(yīng)蛋白(CRP)測定試劑盒,丙二醛(MDA)測定試劑盒,總超氧化物歧化酶(T-SOD)測試盒,谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)測試盒,單胺氧化酶(MAO-B)測試盒,測定試劑盒均購自南京建成科技有限公司,其余配置試劑均為普通市售分析純。
1.2 實驗動物 3月齡雄性Wistar大鼠(SPF級)30只,體重174 g±5.3 g,購自山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司,合格證號:SCXLC魯20080002。動物房溫度(22±2)℃,濕度(60±15)%。自然光照。飼喂大鼠飼料,購自山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司。
1.3 實驗分組和操作 適應(yīng)1 w后開始實驗。將30只大鼠隨機(jī)分為空白組10只,腹腔注射組10只,皮下注射組10只。利用 D-半乳糖0.125 g·kg-1·d-1連續(xù)腹腔和皮下注射40 d。皮下注射部位均為右后大腿內(nèi)側(cè)。末次給藥后24 h,分別稱量3組老鼠的體重,摘眼球取血,離心取血清。另分別取胸腺,脾臟,腹部皮膚和腦組織。稱取胸腺和脾臟重量,皮膚和腦組織一部分在-20℃低溫保藏,另一部浸泡Bouin固定液固定,準(zhǔn)備進(jìn)一步制作切片。
1.4 指標(biāo)測定
1.4.1 計算胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù) 根據(jù)稱量所得的體重,胸腺重量和脾臟重量計算胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)。
1.4.2 血液及組織生化指標(biāo)測定 血清葡萄糖,CRP,MDA,T-SOD,GSH-Px含量,皮膚羥脯氨酸含量以及腦B型單MAO-B含量測定均按照測試盒說明書進(jìn)行,采用分光光度法。
1.4.3 組織切片制作 選取浸泡改良Bouin固定液固定腦和皮膚組織,制作常規(guī)石蠟切片,切片厚度6μm,HE染色后在Nikon顯微鏡下觀察、拍照。
1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 各組實驗數(shù)據(jù)均用SPSS13.0統(tǒng)計軟件做統(tǒng)計學(xué)處理。所得結(jié)果均以x±s表示,并做單因素方差分析。
2.1 大鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù) 在胸腺指數(shù)上,皮下注射組、腹腔注射組與空白組相比均顯著下降(P<0.01)。皮下注射組與腹腔注射組之間無明顯差異,但表現(xiàn)出一定的下降趨勢。在脾指數(shù)上,皮下注射組、腹腔注射組與空白組相比均沒有顯著差異(P>0.05)。皮下注射組與腹腔注射組之間也沒有顯著差異,僅表現(xiàn)下降趨勢。見表1。
表1 不同注射組大鼠的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)(x ± s,n=10)
2.2 血液生化指標(biāo) 在血糖含量上,三組之間沒有明顯差異(P>0.05)。CRP含量上,腹腔注射組、皮下注射組與空白組相比均顯著升高(P<0.01),皮下注射組與腹腔注射組相比明顯升高(P<0.05)。在MDA含量上,腹腔注射組、皮下注射組與空白組相比均顯著升高(P<0.01),腹腔注射組與皮下注射組相比明顯升高(P<0.01)。T-SOD和GSH-Px活性上,腹腔注射組、皮下注射組與空白組相比均明顯降低(P<0.01),腹腔注射組與皮下注射組相比活性降低更加顯著(P<0.01)。見表2。
表2 不同注射組大鼠血液生化指標(biāo)(x ± s,n=10)
2.3 組織生化指標(biāo) 在腦MAO-B活性上,皮下注射組、腹腔注射組與空白組相比均顯著升高(P<0.01),皮下注射組與腹腔注射組相比無明顯差異,僅表現(xiàn)下降趨勢。在皮膚羥脯氨酸含量上,腹腔注射組和皮下注射組與空白組相比均顯著降低(P<0.01),皮下注射組與腹腔注射組相比明顯降低(P<0.05)。見表3。
表3 不同組大鼠的組織生化指標(biāo)(x ± s,n=10)
2.4 皮膚組織切片 空白組皮膚厚度正常,表皮角質(zhì)層完整,基底層細(xì)胞排列整齊。腹腔注射組表皮厚度明顯變薄,表皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)改變且數(shù)量明顯下降,基底層細(xì)胞少數(shù)出現(xiàn)空泡,整體排列仍較整齊。皮下注射組皮膚厚度進(jìn)一步變薄,表皮有部分缺失,基底層細(xì)胞嗜堿性降低,排列疏松紊亂;真皮彈力纖維增粗,堆積,排列不規(guī)則。見圖1。
2.5 腦組織切片 空白組大腦白質(zhì)內(nèi)神經(jīng)元細(xì)胞體清晰可見,結(jié)構(gòu)正常。腹腔注射組大腦白質(zhì)和皮下注射組大腦白質(zhì)內(nèi)神經(jīng)元細(xì)胞體胞質(zhì)不清晰,樹突和軸突縮短消失。腹腔注射組和皮下注射組間差異不大??瞻捉M大腦灰質(zhì)內(nèi)神經(jīng)纖維排列緊密,結(jié)構(gòu)正常。腹腔注射組大腦灰質(zhì)內(nèi)神經(jīng)元細(xì)胞腫脹,但數(shù)量仍較多。皮下注射組大腦灰質(zhì)內(nèi)神經(jīng)元纖維排列疏松,神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量明顯減少。見圖2。
圖1 各組皮膚組織切片(HE,×400)
圖2 各組大鼠大腦白質(zhì)與灰質(zhì)病理圖片(HE,×400)
D-半乳糖導(dǎo)致機(jī)體衰老的主要機(jī)制是:通過連續(xù)注射使D-半乳糖在機(jī)體細(xì)胞內(nèi)累積。細(xì)胞內(nèi)的醛糖還原酶可以將其還原成無法被細(xì)胞代謝的半乳糖醇。胞內(nèi)堆積的半乳糖醇可以影響細(xì)胞的滲透壓,使細(xì)胞腫脹,進(jìn)而使細(xì)胞功能障礙、代謝紊亂,最終導(dǎo)致機(jī)體衰老〔4〕。本實驗表明,兩種注射方法所建立的衰老大鼠模型在各項血液生化指標(biāo)上均有衰老體現(xiàn),衰老大鼠模型已經(jīng)建立。
衰老機(jī)體內(nèi)較高含量的還原糖可與蛋白質(zhì)、脂類、核酸等大分子中的游離氨基發(fā)生非酶促糖基化反應(yīng)。其通過加成反應(yīng)產(chǎn)生的早期產(chǎn)物經(jīng)重排、脫水形成帶熒光的棕色化合物,即晚期糖基化終末產(chǎn)物AGEs。AGEs隨年齡增長不斷積累,從而促進(jìn)機(jī)體衰老〔5〕。通過試驗比較,腹腔注射和皮下注射D-半乳糖沒有引起衰老大鼠血糖升高,與以往的實驗結(jié)果一致〔6〕。其原因可能是注射劑量和時間不足〔7〕。
體內(nèi)C反應(yīng)蛋白水平能夠?qū)C(jī)體的健康及衰老狀況起到警示作用〔8〕。實驗結(jié)果顯示,兩種衰老大鼠模型的CRP水平較空白組明顯升高,說明衰老機(jī)體正處于不健康狀態(tài)。這可能與各器官、免疫系統(tǒng)等功能性衰退有關(guān)。皮下注射組的CRP水平較腹腔注射組較高可能是由于皮下注射D-半乳糖延長了D-半乳糖對機(jī)體的作用時間,從而使機(jī)體對非健康狀態(tài)更加敏感。
衰老的自由基學(xué)說認(rèn)為體內(nèi)產(chǎn)生過多的氧自由基會將不飽和脂肪酸氧化成超氧化物,從而形成脂褐素。過多的氧自由基還會破壞細(xì)胞膜,使蛋白質(zhì)和酶變性,從而加速衰老。氧化物含量和抗氧化酶的活性是評價機(jī)體氧化水平的主要指標(biāo)。MDA是自由基與脂質(zhì)中不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)所產(chǎn)生的過氧化脂質(zhì)的分解產(chǎn)物。因此,MDA的含量可以反映過氧化程度,從而反映衰老程度。超氧物歧化酶(SOD)和GSHPx是機(jī)體內(nèi)重要的清除自由基的抗氧化酶,可以作為衰老的直觀指標(biāo)。試驗中,兩種衰老大鼠模型較空白組高的MDA含量,較低的T-SOD和GSH-Px的活性反映了機(jī)體的衰老狀態(tài)。即,自由基的累積和抗氧化酶活性的降低,與以往實驗結(jié)果一致〔9〕。皮下注射組的MDA含量較腹腔注射組高,但腹腔注射組T-SOD和GSH-Px的活性較皮下注射組更低,表現(xiàn)出兩種衰老大鼠模型在自由基代謝上的差異。說明腹腔注射D-半乳糖建立的衰老大鼠模型的自由基代謝水平較皮下注射組差,自由基的累積程度較高。因此,在進(jìn)行自由基代謝相關(guān)領(lǐng)域的研究時,選取腹腔注射D-半乳糖建立衰老大鼠模型可能會取得更加顯著的效果。本文結(jié)果說明注射D-半乳糖可以使免疫系統(tǒng)功能下降,但是在兩種衰老大鼠模型間差異不大。這個結(jié)果與徐智等〔10〕的研究結(jié)果一致。
腦MAO-B在衰老機(jī)體內(nèi)的累積可以導(dǎo)致兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)的減少,使大腦的反應(yīng)和思維活動遲緩,是衰老的重要指標(biāo)。實驗結(jié)果顯示腹腔注射組,皮下注射組MAO-B活性與空白組相比明顯升高,而腹腔注射組與皮下注射組相比略有升高。腦組織切片的結(jié)果也顯示了這一點。從初步構(gòu)建腦衰老模型的角度出發(fā),注射D-半乳糖可以起到一定的效果,且腹腔注射的效果好一些。
皮膚羥脯氨酸含量的下降可以顯示真皮內(nèi)膠原蛋白含量的降低,從而反映衰老程度〔11〕。實驗結(jié)果顯示腹腔注射組,皮下注射組與空白組相比皮膚羥脯氨酸含量明顯下降,而皮下注射組與腹腔注射組明顯降低。這與皮膚組織切片的結(jié)果一致。說明,皮下注射D-半乳糖的吸收途徑對皮膚的作用更加直接。因此,從實驗結(jié)果可見,在皮膚衰老模型的研究中,皮下注射D-半乳糖效果明顯優(yōu)于腹腔注射D-半乳糖構(gòu)建的大鼠模型,可以應(yīng)用于該領(lǐng)域模型的構(gòu)建。
腹腔注射和皮下注射D-半乳糖構(gòu)建的衰老大鼠模型,兩種方法均可建立穩(wěn)定可靠的衰老大鼠模型,且兩種模型均能在多層面上反映出機(jī)體的衰老情況。從應(yīng)用角度出發(fā),腹腔注射D-半乳糖構(gòu)建的大鼠模型較皮下注射D-半乳糖構(gòu)建的大鼠模型在機(jī)體應(yīng)激研究、自由基代謝研究、腦衰老研究中有較好的效果。而皮下注射D-半乳糖構(gòu)建的大鼠模型較腹腔注射D-半乳糖構(gòu)建的大鼠模型在皮膚衰老模型的研究中效果更突出。
本文發(fā)現(xiàn),注射D-半乳糖構(gòu)建衰老大鼠模型,腹腔注射的方法要比皮下注射方法造模效果更加明顯。這種差別可能是因為腹腔注射法是將D-半乳糖注射入腹腔胃腸道漿膜以外,腹膜以內(nèi)。由于腹膜的面積廣大且密布血管和淋巴管,因此腹膜有很強(qiáng)的吸收能力,每小時可吸收動物體重3% ~8%的液體,因而對血液指標(biāo)的影響更大。皮下注射D-半乳糖則是將D-半乳糖推入皮下結(jié)締組織,D-半乳糖經(jīng)皮下結(jié)締組織間的毛細(xì)血管、淋巴管吸收進(jìn)入血液循環(huán),因而對皮膚組織和羥脯氨酸含量的影響更大。兩種不同的注射方法導(dǎo)致大鼠機(jī)體對D-半乳糖的藥代動力學(xué)差異,而藥代動力學(xué)上的差異是導(dǎo)致兩種衰老大鼠模型之間差異的主要原因。
1 董曉華,張丹參,武海霞.衰老動物模型的研究進(jìn)展及評價〔J〕.河北北方學(xué)院學(xué)報,2004;21(6):41-3.
2 洪 亮,方 勝.三種不同方法建立小鼠衰老模型的比較〔J〕.中國老年學(xué)雜志,2010;30(18):2607-8.
3 邢秋娟,施 祀,王擁軍.D-半乳糖誘導(dǎo)衰老動物模型的機(jī)制及其在中醫(yī)藥方面的應(yīng)用〔J〕.上海中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2010;24(3):93-8.
4 Song X,Bao M,Li D.Advanced glycation in D-galactose induced mouse aging mode〔l J〕.Mech Ageing Dev,1999;108(3):239-2511.
5 熊愛華,鄭 浩,呂俊華.D-半乳糖誘導(dǎo)大鼠腦損傷的糖基化機(jī)制〔J〕.中國實驗動物學(xué)報,2008;16(3):196-200.
6 王吉吉,趙新華,陸承榮,等.D-半乳糖亞急性中毒大鼠擬衰老生理生化改變〔J〕.實驗動物科學(xué)與管理,1999;16(2):24-5.
7 李 冰,鄭 浩.D-半乳糖誘導(dǎo)大鼠腎臟損害的糖基化機(jī)制及藥物干預(yù)作用〔J〕.中國實驗動物學(xué)報,2008;16(6):435-40.
8 姜 帆,胡 瓊,姜 船.C反應(yīng)蛋白在臨床醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用〔J〕.檢驗醫(yī)學(xué)與臨床,2011;8(2):254-5.
9 崔美芝,劉 浩,李春艷.衰老動物模型的建立及評價〔J〕.中國比較醫(yī)學(xué)雜志,2006;16(2):118-21.
10 徐 智,吳國明,錢桂生,等.大鼠衰老模型的初步建立〔J〕.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報,2003;25(4):312-5.
11 石麗君,吳 鐵,吳志華.D-半乳糖誘導(dǎo)大鼠皮膚衰老的形態(tài)學(xué)與生化指標(biāo)觀察〔J〕.中華皮膚科雜志,2005;38(3):165-7.