降鈣素對兔膝骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡及相關(guān)基因的影響

尤笑迎 楊紅梅

(鄭州人民醫(yī)院骨科，河南 鄭州 450003)

膝骨性關(guān)節(jié)炎(KOA)是以滑膜和關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)破壞和功能障礙為主要病理改變的慢性退行性骨關(guān)節(jié)疾病，是導(dǎo)致關(guān)節(jié)疼痛、畸形的主要原因，嚴(yán)重影響老年人的生活質(zhì)量，研究發(fā)現(xiàn)其發(fā)生、發(fā)展與軟骨細(xì)胞的凋亡有關(guān)〔1〕。本實驗通過建立不穩(wěn)定膝關(guān)節(jié)誘導(dǎo)骨性關(guān)節(jié)炎模型，觀察了降鈣素對KOA發(fā)病過程中關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡和相關(guān)基因的影響，從而探討降鈣素治療KOA的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 鮭魚降鈣素(1 ml:50 U/支，H20050501，北京諾華制藥有限公司);生物顯微鏡(日本，OLYMPUS);TUNELL檢測試劑盒(上海銳聰科技發(fā)展有限公司);bcl-2免疫組化試劑盒(武漢博士德生物制劑有限公司)。

1.2 模型制備及實驗分組 4～6月齡健康大耳白兔36只，體質(zhì)量2.5～3.0 kg，雌雄不限，隨機(jī)分為空白對照組(A組)、模型組(B組)、降鈣素治療組(C組)，每組12只。B、C兩組采用改良Hulth法復(fù)制膝骨性關(guān)節(jié)炎，經(jīng)耳緣靜脈緩慢推注50%乙醇(5 ml/kg)進(jìn)行麻醉，左下肢膝關(guān)節(jié)及周圍備皮、消毒，取膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)入路，切斷內(nèi)側(cè)副韌帶，摘除內(nèi)側(cè)1/3半月板，切斷前交叉韌帶，避免損傷關(guān)節(jié)軟骨，縫合關(guān)節(jié)囊及皮膚，A組除切開皮膚和關(guān)節(jié)腔外，不做其他處理。術(shù)后連續(xù)7 d青霉素20萬U肌肉注射，分籠飼養(yǎng)，1 w后開始每天強(qiáng)迫活動1 h，連續(xù)4 w，從術(shù)后第6周開始C組每天皮下注射降鈣素5 U/kg，A、B組給予等量生理鹽水皮下注射。

1.3 軟骨標(biāo)本的制備 實驗結(jié)束后，經(jīng)耳緣靜脈空氣栓塞處死動物，立即切開膝關(guān)節(jié)腔，用銳利刀片切取股骨內(nèi)髁關(guān)節(jié)軟骨，修成0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm，經(jīng)冰生理鹽水沖洗后置入4%多聚甲醛液(pH 7.4)固定72 h，15%乙二胺四乙酸(EDTA)脫鈣12周，石蠟包埋，常規(guī)切片備用。

1.4 檢測指標(biāo)

1.4.1 軟骨組織大體形態(tài)觀察 動物處死后，打開關(guān)節(jié)腔，觀察膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)囊、滑膜、關(guān)節(jié)軟骨及關(guān)節(jié)液是否清澈，按Pelletier JP標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分，0分:關(guān)節(jié)面透明光整、色澤正常;1分:關(guān)節(jié)面粗糙，有小的裂隙且色澤灰暗;2分:關(guān)節(jié)面糜爛，軟骨缺損深達(dá)軟骨表層和中層;3分:關(guān)節(jié)面有潰瘍，缺損深達(dá)軟骨深層;4分:軟骨剝脫，軟骨下骨質(zhì)暴露。

1.4.2 顯微鏡下觀察 切片進(jìn)行常規(guī)HE(蘇木素-伊紅)染色，顯微鏡下觀察軟骨形態(tài)變化，并參照Mankin改良的關(guān)節(jié)軟骨病理評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行積分統(tǒng)計。

1.4.3 軟骨細(xì)胞凋亡情況檢測 采用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的原位末端平移法(TUNEL)檢測軟骨細(xì)胞的凋亡情況，嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行操作。光鏡下以細(xì)胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，每張切片隨機(jī)選取5個不重疊高倍視野，計算陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。

1.4.4 軟骨組織bcl-2蛋白表達(dá)情況檢測 采用免疫組織化學(xué)染色法進(jìn)行，嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行操作，用PBS代替一抗作為陰性對照，陽性結(jié)果為軟骨細(xì)胞質(zhì)呈棕褐色或棕黃色顆粒，HPIAS-1000高清晰彩色病理圖像分析系統(tǒng)(同濟(jì)千屏)測定陽性細(xì)胞的灰度值，取每張切片均值作為測量值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以x±s表示，用 t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 造模過程中，動物良好無死亡，術(shù)后膝關(guān)節(jié)感染2只，均被淘汰，列入觀察的共34只，A組11只，B組11只，C組12只，余動物實驗期間健康狀況良好。術(shù)后3～5 d膝關(guān)節(jié)腫脹較明顯，關(guān)節(jié)腔積液，雙后肢力量減低，活動頻次減少，1 w后逐漸好轉(zhuǎn)，B、C組動物膝關(guān)節(jié)不穩(wěn)，有異?；顒佣?，4 w后膝關(guān)節(jié)畸形腫大，A組關(guān)節(jié)外部結(jié)構(gòu)正常，無腫脹，活動自如。

2.2 大體形態(tài)觀察 A組關(guān)節(jié)軟骨半透明狀，外觀呈藍(lán)白色，色澤明亮，無裂紋及軟化，關(guān)節(jié)液清亮透明，滑膜無增生;B組關(guān)節(jié)軟骨失去原有光澤，表面粗糙，呈灰黃色，有軟骨缺損，尤以股骨內(nèi)髁明顯，滑膜不同程度增生粘連，關(guān)節(jié)液增多、混濁，呈泡沫狀;C組關(guān)節(jié)軟骨色澤變淡，光澤度降低，滑膜可見少量增生，關(guān)節(jié)液略增多。各組股骨髁軟骨退變評分見表1。

表1 各組股骨髁軟骨退變分級(n)

2.3 光鏡觀察結(jié)果 A組關(guān)節(jié)軟骨4層結(jié)構(gòu)清晰可辨，軟骨面平滑規(guī)整，結(jié)構(gòu)正常無裂隙，軟骨細(xì)胞排列整齊，未見軟骨細(xì)胞簇，基質(zhì)均勻，潮線完整;B組軟骨表層變薄、粗糙，裂隙較多，有軟骨細(xì)胞簇集現(xiàn)象，潮線多不完整或消失;C組軟骨4層結(jié)構(gòu)可辨，軟骨表面較規(guī)則、裂隙少，軟骨細(xì)胞排列較整齊，潮線尚完整，見圖1，Mankin評分見表2。

圖1 各組關(guān)節(jié)軟骨光鏡觀察結(jié)果(HE，×200)

2.4 軟骨細(xì)胞凋亡及bcl-2蛋白表達(dá)情況檢測結(jié)果 A組偶見軟骨細(xì)胞凋亡，B組軟骨全層可見大量凋亡的軟骨細(xì)胞，C組軟骨細(xì)胞凋亡情況介于前兩者之間。見圖2和表2;bcl-2蛋白表達(dá)情況見圖3和表2。

表2 各組Mankin評分、軟骨細(xì)胞凋亡及bcl-2蛋白表達(dá)情況(x±s)

圖2 各組關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡情況(TUNELL法，×200)

圖3 各組關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞bcl-2表達(dá)情況(DAB，×200)

3 討論

細(xì)胞凋亡是生理或病理情況下，通過基因調(diào)控的細(xì)胞死亡形式之一。研究發(fā)現(xiàn)正常關(guān)節(jié)軟骨中有細(xì)胞凋亡的發(fā)生，認(rèn)為正常軟骨中發(fā)生凋亡現(xiàn)象是細(xì)胞生長與分化過程中的一種生理現(xiàn)象，另有研究發(fā)現(xiàn)軟骨細(xì)胞的凋亡過度是關(guān)節(jié)軟骨退變發(fā)展成骨關(guān)節(jié)病的重要原因，關(guān)節(jié)軟骨的細(xì)胞凋亡參與了骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病〔2〕。細(xì)胞凋亡受基因的調(diào)控，bcl-2是抑制細(xì)胞凋亡的重要基因，Erlacher等〔3〕在轉(zhuǎn)錄和蛋白水平研究OA患者及健康成人關(guān)節(jié)軟骨中bcl-2的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，OA患者bcl-2 mRNA表達(dá)水平較高，鄰近軟骨缺損區(qū)的軟骨細(xì)胞高表達(dá)bcl-2蛋白，認(rèn)為機(jī)體通過上調(diào)Bcl-2表達(dá)保護(hù)軟骨細(xì)胞免遭凋亡。

本實驗采用Hulth法復(fù)制動物OA模型，通過改變膝關(guān)節(jié)生物力學(xué)狀態(tài)以誘導(dǎo)關(guān)節(jié)軟骨退變，建立骨關(guān)節(jié)炎模型，通過Pelletier JP軟骨組織大體評分和改良的Mankin關(guān)節(jié)軟骨病理評分進(jìn)行嚴(yán)格評價，發(fā)現(xiàn)與A組相比較，B組JP和Mankin評分明顯升高，而此兩種評分是反映骨關(guān)節(jié)炎病變嚴(yán)重程度的定量分析方法，病變越重，分值越大，積分越高，說明軟骨損傷越嚴(yán)重，因此該實驗結(jié)果表明B組動物膝關(guān)節(jié)軟骨破壞嚴(yán)重，同時軟骨細(xì)胞凋亡百分?jǐn)?shù)和bcl-2表達(dá)均明顯升高(P＜0.05)，與Lin等〔4〕研究結(jié)果一致，說明本實驗KOA動物模型復(fù)制成功，且軟骨細(xì)胞凋亡參與了KOA發(fā)病過程，而bcl-2表達(dá)的增多則可能是KOA過程中機(jī)體自身的一種保護(hù)機(jī)制。

降鈣素是一種抗再吸收藥物，長期以來一直用于治療骨質(zhì)疏松，且證實了其治療骨量減少疾病的有效性和安全性，并且可影響OA關(guān)節(jié)損傷的進(jìn)程〔5，6〕。本研究提示CT對KOA具有治療作用，可減輕關(guān)節(jié)軟骨的損傷;同時發(fā)現(xiàn)，與B組相比，軟骨細(xì)胞凋亡百分?jǐn)?shù)明顯減少，而bcl-2表達(dá)則進(jìn)一步明顯升高(P＜0.05)，說明降鈣素可能通過上調(diào)bcl-2的表達(dá)調(diào)控軟骨細(xì)胞異常凋亡，而達(dá)到治療KOA的作用，至于其具體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有待進(jìn)一步研究。

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