大鼠骨髓間充質干細胞的分離、培養(yǎng)和鑒定

王翠艷 魏芳晶 陰淑瑩 李云霞 張曉云 喬曉娟 石秀換

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院保健中心一病區(qū)，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010050)

骨髓間充質干細胞(MSCs)〔1〕是從骨髓中分離培養(yǎng)出的一種多潛能干細胞，具有很強的自我復制和多向分化潛能，可產(chǎn)生具有各種表型的子代細胞，還能通過與造血細胞密切接觸，分泌細胞外基質和多種細胞調(diào)節(jié)因子調(diào)節(jié)造血，并且可分泌多種生長因子和細胞因子。研究表明〔2〕，MSCs還能分化為心肌細胞，能補充丟失的心肌細胞，促進血管新生，從而修復受損心肌，改善心功能。另外，MSCs自體移植可避免免疫抑制劑的使用，同時MSCs易于外源基因的轉染和表達，從而增強或調(diào)控移植后的治療作用。因此MSCs被用作表達目的基因的細胞平臺，在治療缺血性心肌病方面?zhèn)涫荜P注。本文根據(jù)MSCs貼壁生長的特性進行分離和培養(yǎng)，并觀察其生長形態(tài)，對其表型和生長曲線進行初步鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑 DMEM培養(yǎng)基(低糖)(GibcoBRL公司)，胎牛血清(天津TBD灝洋有限公司)4%臺盼藍母液(上海亞培生物科技有限公司)，胰蛋白酶(Gibco公司)，兔抗大鼠CD34、CD44單抗(博奧森公司)，SP試劑盒 (福建邁新公司)，DAB顯色試劑盒(北京中杉公司)，F(xiàn)ITC抗大鼠/小鼠CD90.1單抗(Ebioscience公司)、超凈臺(北京半導體設備一廠)、CO2培養(yǎng)箱(SNAYO公司)、倒置顯微鏡。

1.2 實驗方法

1.2.1 MSCs分離、純化及培養(yǎng) 取6 w左右體重120～150 g雄性大鼠，斷頸處死，無菌條件下分離脛骨、股骨，全骨髓培養(yǎng)法提取細胞，放于胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，搖勻后放入37℃，5%CO2箱中進行培養(yǎng)。提取細胞3 d后首次換液，此后每隔3天換一次液。原代培養(yǎng)時生長較慢約14 d左右達90%融合，0.25%胰酶消化約1 min左右進行傳代，首次傳代后生長較快，約每7天傳一次代。通過貼壁培養(yǎng)法和嚴格控制酶的量和消化時間，利用MSCs較易脫落的特點，保證MSCs在短暫的作用時間內(nèi)與培養(yǎng)瓶底分開，從而使MSCs得到純化。

1.2.2 繪制MSCs生長曲線 取生長良好的1、3代細胞，0.25%胰蛋白酶消化，以5×106/ml密度接種于24孔板中，每孔400μl，至于37℃，5%CO2箱中進行培養(yǎng)。第二天(大約30 h后)開始每隔24 h取4孔，用臺盼藍法進行讀數(shù)。連續(xù)讀14 d。以培養(yǎng)時間為橫軸，細胞數(shù)為縱軸，描繪生長曲線。

1.2.3 MSCs表型分析 取第3代生長狀態(tài)良好的細胞，制成細胞爬片，4%多聚甲醛固定，PBS沖洗，過氧化氫消除內(nèi)源性過氧化物酶，滴加非免疫動物血清，加一抗(兔抗大鼠 CD44、CD34)，同時用 PBS作為一抗設置陰性對照，4℃濕盒過夜，加生物素化二抗，加 SABC，DAB顯色，蘇木素染色，脫水、封片、顯微鏡下觀察。取第3代生長狀態(tài)良好的細胞，制成單細胞懸液，以2×106細胞/ml，500μl分裝于3支1.5 mlEP管中，其中2支加抗大鼠CD90-FITC，一支加PBS，混勻，避光孵育，加1 ml PBS混勻，用流式細胞儀檢測細胞表面抗原CD90表達。

2 結果

2.1 細胞培養(yǎng) 見圖1初接種的細胞呈圓形，24 h時部分細胞開始貼壁，72 h時貼壁細胞明顯增多，部分細胞伸出偽足呈紡錘樣、長梭形，細胞核較大，呈圓形或橢圓形，核膜邊界清楚。更換培養(yǎng)液。接種第1周內(nèi)，細胞增殖緩慢，10 d后細胞增殖速度明顯加快，第12～14天時細胞集落達90%融合。傳代后細胞生長速度明顯加快，于6～8 h開始貼壁，24 h后開始分裂，生長迅速，培養(yǎng)6～7 d可達90%融合。第3代以后細胞純度較高，以梭形細胞為主，排列有一定的方向性，呈漩渦樣生長，漩渦中心細胞呈多層分布，細胞界限不清。

圖1 MSCs生長狀態(tài)(×200)

2.2 繪制MSCs生長曲線 原代接種后的1～5 d為MSCs生長的潛伏期，此期主要為MSCs的貼壁生長階段，培養(yǎng)細胞的有絲分裂活動不甚活躍;約7 d后，細胞生長速度開始加快;10 d后細胞生長達指數(shù)生長期;第14天達到高峰進入平臺期。傳代細胞的生長速度較原代快，潛伏期為24 h，3～4 d細胞生長達指數(shù)生長期;接種后7 d達到高峰，然后生長逐漸緩慢，進入平臺期。見圖2。

圖2 MSCs生長曲線

2.3 MSCs表型特征 免疫細胞化學染色顯示3代細胞CD44為陽性反應，可見細胞膜呈棕黃色著色，胞漿輕度著色;而造血干細胞和淋巴細胞的標志CD34免疫組化染色為陰性。表明MSCs有CD44抗原表達，具有間質細胞的標志。見圖3。流式細胞分析法檢測表面標志物顯示均一的表達MSCs標志CD90，陽性99%以上。

圖3 免疫組化法MSCs細胞表面標志表達(×200)

3 討論

骨髓來源的干細胞主要包括造血干細胞〔3〕(HSCs)、MSCs和血管內(nèi)皮祖細胞(EPCs)。MSCs來源于中胚層，能夠支持和維持造血微環(huán)境。在調(diào)節(jié)造血干細胞的長期存活及生長分化過程中起重要作用，且能夠分化成多種中胚層來源的間葉組織細胞。最早在1867年Cobnhein首次提出骨髓具有造血以外的功能，直到1968年才被在實驗中發(fā)現(xiàn)和命名。1997年Asahara T等在體外成功的分離培養(yǎng)出MSCs。MSCs的突出特點是具有自我更新和多向分化潛能。在不同的誘導條件下可以向不同的胚系分化，而且可以跨胚層分化〔4〕。

目前已經(jīng)建立了多種體外分離、純化、培養(yǎng)MSCs的方法:①貼壁篩選法，②密度梯度離心法，③流式細胞儀分選法，④免疫磁珠法。本實驗采用的是貼壁篩選法，將骨髓細胞直接進行貼壁培養(yǎng)，通過反復、多次換液去除未貼壁的造血干細胞，獲得貼壁生長的MSCs，用L-DMEM+15%FBS作為基本培養(yǎng)基，通過換液、傳代進行純化和擴增培養(yǎng)。文獻報道〔5〕體外培養(yǎng)的MSCs，在形態(tài)上呈紡錘形成纖維細胞狀，能附著在塑料或玻璃培養(yǎng)皿上生長，形成均勻的集落或貼壁的融合層，而無明顯的接觸抑制。本研究也證實了上述觀察結果。從細胞生長曲線上可以看出，無論原代培養(yǎng)還是傳代培養(yǎng)，各代細胞均具有明顯的潛伏期、對數(shù)增長期和平臺期，具有常規(guī)細胞體外培養(yǎng)的特點。MSCs是一群具有獨特表型及細胞化學特征的處于未分化狀態(tài)的非定向干細胞〔6〕，MSCs可以表達細胞因子(IL-1a、IL-6、IL-7、IL-8、IL-11、IL-12、SCF、LIF、M-CSF 等);細胞因子受體(IL-1R、IL-3R、IL-7R、G-CSFR、PDGFR 等);MSC 的表型不均一，具有間質細胞、上皮細胞和內(nèi)皮細胞的特點，即MSCs可以表達多種黏附相關分子，如整合素亞基a3、a4、a5、β以及整合素 avβ3、avβ5、ICAM-1、CD44H 等。它對表面抗原 SB-10、SH-2、SH-3、SH-4、CD29、CD44、CD71、CD90、CD106、CD120a、和 CD124等均呈陽性反應，而對造血細胞的CD14、CD34、CD45抗原均呈陰性反應。本實驗觀察了MSCs細胞3種表面分子抗原的表達顯示:CD44，CD90陽性而CD34陰性，均符合已有證實的結果。

綜上，本研究建立了采用貼壁篩選法體外分離純化MSCs方法分離純化所得的MSCs純度高，具有干細胞特征，適用于基因治療和細胞治療，為下一步研究奠定基礎。

1 Jain M，Pfister O，Roger J，et al.Mesenchymal stem cells in the infarcted heart〔J〕.Coronary Artery Dis，2005;16(2):93-7.

2 Herzog EL，Chai L，Krause DS，et al.Plasticity of marrow-derived stem cells〔J〕.Blood，2003;102(10):3483-93.

3 范阜東，王東進.骨髓干細胞移植治療缺血性心臟病的現(xiàn)狀與前景〔J〕.心血管病學進展，2008;29(5):778-81.

4 Lorena Zentilin，Sabrina Tafuro，Serena Zacchigna，et al.Bone marrow mononuclear cells are recruited to the sites of VEGF-induced neovascularization but are not incorporated into the newly formed vessels〔J〕.Blood，2006;107(9):3546-54.

5 華 平，陳 炬，張惠忠，等.血管內(nèi)皮生長因子基因轉染骨髓間充質干細胞移植于梗死心肌的實驗研究〔J〕.中華顯微外科雜志，2006;29(5):947-51.

6 Gao F，He T，Wang H，et al.A promising strategy for the treatmen to fischemic heart disease:mesenchymal stem cell-mediated vascular endothelial growth factor gene transfer in rats〔J〕.Can JCardiol，2007;23:891-8.