急性胎兔宮內(nèi)窘迫模型腦組織病理及NMDAr1表達(dá)實(shí)驗(yàn)研究

林也容 林進(jìn)皇 吳芳芳 郁毅剛▲

1.解放軍第一七五醫(yī)院暨廈門大學(xué)附屬東南醫(yī)院婦產(chǎn)科，福建漳州 363000；2.解放軍第一七五醫(yī)院暨廈門大學(xué)附屬東南醫(yī)院神經(jīng)外科，福建漳州 363000

胎兒在宮內(nèi)有缺氧征象危及胎兒健康和生命者，稱為胎兒窘迫（fetal distress，F(xiàn)D）[1]，是胎兒圍產(chǎn)期死亡及新生兒神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥的常見原因，占圍產(chǎn)兒死亡原因的首位[2]，給社會(huì)、家庭和個(gè)人帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)。深入研究FD的發(fā)病機(jī)制，包括病理生理機(jī)制和分子機(jī)制，具有重要的意義。本研究通過(guò)建立急性胎兔宮內(nèi)窘迫模型，觀察研究其胎兔腦組織病理及NMDAr1表達(dá)情況。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組

健康成年新西蘭大白兔4周左右孕兔，普通級(jí)。體質(zhì)量3.2～3.7kg，由上海松江松聯(lián)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物場(chǎng)生產(chǎn)，廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供。動(dòng)物許可證：SCXK（滬）2007-0011。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用單位許可證編號(hào)：SYXK（軍）2002-47。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)人員資質(zhì)許可證編號(hào)：軍動(dòng)管字第2006E01028。實(shí)驗(yàn)孕兔飼養(yǎng)3d，每日傍晚測(cè)體溫、脈搏、呼吸1次。至孕32～34d實(shí)驗(yàn)，剔除異常極值動(dòng)物，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，個(gè)體間無(wú)明顯差異。編號(hào)按隨機(jī)表分成3組，缺血模型組9只，假手術(shù)組9只，空白組12只。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

模型制作：妊娠34d孕兔以2.5%戊巴比妥鈉0.1mL/100g進(jìn)行腹腔麻醉后，恥區(qū)下腹部正中切口打開腹腔，暴露雙側(cè)子宮角，檢查胎盤、子宮及孕兔活力。分離出進(jìn)入每個(gè)胎盤的分支動(dòng)脈血管，以無(wú)創(chuàng)動(dòng)脈夾鉗夾20min，然后松開血管夾，恢復(fù)血流，建立急性胎兔宮內(nèi)窘迫模型。缺血模型組孕兔行開腹子宮動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)，建立胎兔宮內(nèi)窘迫缺血缺氧模型；假手術(shù)組孕兔行開腹術(shù)，不結(jié)扎子宮動(dòng)脈；空白組孕兔不行任何手術(shù)處理。除空白組胎兔直接斷頭取腦外，其他組胎兔均在手術(shù)處理后6h斷頭處死、取腦，固定，顯微鏡下觀察各組胎兔腦組織病理形態(tài)及NMDAr1表達(dá)情況。

1.3 腦組織病理檢測(cè)

取4%甲醛固定腦組織，石蠟包埋，切片行HE染色，光鏡下觀察形態(tài)學(xué)變化，由同一病理醫(yī)生采用盲法評(píng)價(jià)。觀察腦組織結(jié)構(gòu)層次是否完整，神經(jīng)細(xì)胞腫脹、變性、壞死，間質(zhì)出血、水腫等情況。

1.4 腦組織NMDAr1免疫組化表達(dá)的測(cè)定

取4%甲醛固定腦組織，石蠟包埋，連續(xù)切片（4μm），每例標(biāo)本切5張免疫組化染色用。采用改進(jìn)型SP法進(jìn)行免疫組化染色，嚴(yán)格參照試劑盒說(shuō)明操作。試劑盒型號(hào)，購(gòu)于XX公司。每次染色時(shí)均用已知陽(yáng)性切片作陽(yáng)性對(duì)照，用PBS（磷酸緩沖液，0.01mol/L，pH值7.2）代替一抗作陰性對(duì)照。NMDAr1表達(dá)均位于胞質(zhì)和胞核內(nèi)，表現(xiàn)為淺黃、棕黃或棕褐色。用半定量法評(píng)估其染色，無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為（-），陽(yáng)性細(xì)胞數(shù) 25% 以下為（+），25%～50% 為（++），51%～75%為（+++），超過(guò) 75% 為（++++）。

2 結(jié)果

2.1 腦組織HE染色結(jié)果

HE染色空白組胎兔腦組織切片示，腦皮質(zhì)各層發(fā)育正常，其中分子層，內(nèi)顆粒層、外顆粒層以及錐體細(xì)胞層均勻致密，完整；錐體細(xì)胞數(shù)量中等，胞體較小致密，軸突干凈完整、延伸，胞核居中。白質(zhì)間少量血管，肌漿紅染，膠質(zhì)豐富；血管腔內(nèi)可見紅細(xì)胞（圖1～2）。假手術(shù)組腦組織切片HE顯示，各層結(jié)構(gòu)存在，錐體細(xì)胞數(shù)量中等，基本同空白組。胞體稍腫脹，未見明顯空泡變性，軸突完整，光滑延伸；細(xì)胞間偶見少量紅細(xì)胞，無(wú)明顯間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤(rùn)（圖3～4）。HE染色缺血模型組切片示，胎兔腦皮層組織結(jié)構(gòu)層紊亂，部分壞死崩解，分界不清；錐體胞胞體腫脹，數(shù)量稀少，單細(xì)胞體積明顯增大，形態(tài)不規(guī)則，邊緣較毛糙，胞膜胞質(zhì)融合。軸突斷裂崩解，白質(zhì)稀疏；間質(zhì)充血水腫，散在紅細(xì)胞及漿細(xì)胞浸潤(rùn)（圖 5～6）。

圖1 空白組HE染色（×100）

圖2 空白組HE染色（×400 ）

圖3 假手術(shù)組HE染色（×100）

圖4 假手術(shù)組HE染色(×400）

圖5 缺血模型組HE染色（×100）

圖6 缺血模型組HE染色（×400 ）

2.2 腦組織NMDAr1免疫組化的表達(dá)

各組胎兔腦切片神經(jīng)元錐體細(xì)胞均有NMDAr1表達(dá)，主要在神經(jīng)元膜表面表達(dá)，免疫反應(yīng)強(qiáng)度有差異?？瞻捉M見神經(jīng)元形態(tài)完整、胞膜淡染，NMDAr1蛋白少量表達(dá)（+）（圖7～8）。假手術(shù)組，與空白組基本一致，胞體結(jié)構(gòu)完整，數(shù)量中等，細(xì)胞膜不典型黃染（+），NMDAr1少量表達(dá)（圖9～10）。缺血模型組可見神經(jīng)元壞死崩解，少量殘存神經(jīng)元形態(tài)粗糙，胞體腫脹，體積巨大，胞核溶解，大部分胞質(zhì)、胞膜均黃染，色深；NMDAr1大量表達(dá)（+++）（圖11～12）?？瞻捉M和假手術(shù)組NMDAr1免疫反應(yīng)強(qiáng)度均低于缺血模型組，缺血模型組NMDAr1蛋白呈神經(jīng)元膜及胞漿內(nèi)強(qiáng)性表達(dá) 。

圖7 空白組Nr1組化（×100）

圖8 空白組Nr1組化(×400）

圖9 假手術(shù)組Nr1組化（×100）

圖10 假手術(shù)組Nr1組化(×400）

圖11 缺血模型組Nr1組化（×100 ）

圖12 缺血模型組Nr1組化（×400）

3 討論

胎兒宮內(nèi)窘迫是由于胎兒缺血缺氧所引起，可發(fā)生在臨產(chǎn)后，也可發(fā)生在妊娠期，是導(dǎo)致死胎死產(chǎn)主要原因之一[3]，可分為急性胎兒窘迫和慢性胎兒窘迫[4]。研究急性宮內(nèi)窘迫腦組織病理形態(tài)有助于腦缺血缺氧性損傷病理生理機(jī)制的深入了解，對(duì)該病的積極治療和改善預(yù)后等發(fā)展亦具有相當(dāng)重要的意義。

本實(shí)驗(yàn)研究中，我們選擇了與人解剖及生理相似程度較高的兔子作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，通過(guò)對(duì)缺血模型組孕兔行開腹子宮動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)，建立急性胎兔宮內(nèi)窘迫模型。在術(shù)后6h斷頭取腦，固定后HE染色，顯微鏡下發(fā)現(xiàn)胎兔腦皮層組織結(jié)構(gòu)層紊亂，部分壞死崩解，分界不清；錐體胞體腫脹，數(shù)量稀少，單細(xì)胞體積明顯增大，形態(tài)不規(guī)則，邊緣較毛糙，胞膜胞質(zhì)融合。軸突斷裂崩解，白質(zhì)稀疏；間質(zhì)充血水腫，散在紅細(xì)胞及漿細(xì)胞浸潤(rùn)。而只行開腹術(shù)不行子宮動(dòng)脈結(jié)扎的假手術(shù)組胎兔腦病理組織形態(tài)與缺血模型組差異明顯，而與空白組基本相同，腦皮質(zhì)各層結(jié)果存在，其中分子層，內(nèi)顆粒層、外顆粒層以及錐體細(xì)胞層均勻致密，完整；錐體細(xì)胞數(shù)量中等，胞體稍腫脹，未見明顯空泡變性，軸突完整，光滑延伸；細(xì)胞間偶見少量紅細(xì)胞，無(wú)明顯間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤(rùn)。本實(shí)驗(yàn)中，缺血模型組胎兔的神經(jīng)病理改變情況與郭世杰等[5]研究報(bào)告的相似，所以該模型可成功復(fù)制急性宮內(nèi)窘迫癥，病理形態(tài)表現(xiàn)明顯，能夠幫助我們更好觀察研究其病理生理過(guò)程。

除了病理觀察，我們還對(duì)胎兔腦神經(jīng)元錐體細(xì)胞進(jìn)行免疫組化染色，發(fā)現(xiàn)各組均有NMDAr1表達(dá)，主要在神經(jīng)元膜表面表達(dá)，免疫反應(yīng)強(qiáng)度差異較明顯。假手術(shù)組與空白組基本一致，NMDAr1均少量表達(dá)，而缺血模型組NMDAr1大量表達(dá)（+++）。缺血模型組NMDAr1免疫反應(yīng)強(qiáng)度高于空白組和假手術(shù)組，其神經(jīng)元膜及胞漿內(nèi)呈強(qiáng)陽(yáng)性。由此不難看出，缺血模型組的病理學(xué)損傷伴隨著NMDAr1蛋白表達(dá)，我們可以推斷NMDA受體的高表達(dá)和激活導(dǎo)致腦組織缺血缺氧性損傷，這與早期實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果基本一致[6-7]。

NMDA受體由 3種亞基組成： NR1、NR2（A-D）和NR3（A-B）[8]。NR1是能單獨(dú)構(gòu)成離子通道的功能亞基，而NR2和NR3是不能單獨(dú)構(gòu)成離子通道的調(diào)節(jié)亞基，分別增強(qiáng)或抑制NR1亞基的功能。NR1和NR2的表達(dá)是NMDA受體發(fā)揮功能所必需的，NR3則不是NMDA受體發(fā)揮功能所必需的[9]。因此，NMDArl蛋白表達(dá)的變化可反映NMDAr蛋白表達(dá)的變化。胚胎期或新生期腦組織內(nèi)NMDA受體表達(dá)量較其他時(shí)期高，這對(duì)于腦發(fā)育如學(xué)習(xí)和記憶等非常重要。但當(dāng)損傷因素存在時(shí)NMDA受體的過(guò)高表達(dá)又可損傷神經(jīng)系統(tǒng)，因此NMDAR表達(dá)具有“雙刃劍”作用[10]。本研究也證實(shí)了當(dāng)出現(xiàn)急性宮內(nèi)窘迫時(shí)，胎兔的腦組織內(nèi)代表NMDA受體的NMDAr1表達(dá)顯著增高，這是胎兔腦組織損傷的關(guān)鍵機(jī)制之一。

急性宮內(nèi)窘迫常致缺血性腦損傷，其機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，NMDA受體的過(guò)度激活是其中關(guān)鍵點(diǎn)之一，是損傷后諸多繼發(fā)性病理改變的初始“鑰匙”環(huán)節(jié)[11]。作為一種興奮性氨基酸的特異性離子型受體，當(dāng)NMDA受體被過(guò)度激活時(shí)，大量Ca2+流入細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)而觸發(fā)一系列生化過(guò)程[12]： 激活依賴Ca2+的蛋白水解酶；激活磷酸脂酶C、A1、A2，使膜磷脂水解，花生四烯酸釋放增加；使神經(jīng)遞質(zhì)DA釋放增加；自由基大量形成，線粒體氧化磷酸化脫偶聯(lián)，細(xì)胞呼吸抑制；激活核酸內(nèi)切酶，引起DNA分解。這些生化過(guò)程最終促使了神經(jīng)元壞死和凋亡等病理改變[13]，與本實(shí)驗(yàn)的病理結(jié)果一致。

綜上，通過(guò)建立急性宮內(nèi)窘迫模型，觀察到了腦組織NMDAr1表達(dá)及病理?yè)p傷情況，為NMDA受體過(guò)度激活致腦組織損傷提供理論依據(jù)，對(duì)于進(jìn)一步深入研究急性宮內(nèi)窘迫腦組織損傷機(jī)制具有重要意義。

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