鎘在方斑東風(fēng)螺組織內(nèi)的蓄積及鎘的毒性:水相暴露與食物相暴露比較

薛明，柯才煥

1．廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，湛江524025

2．廈門大學(xué)海洋與地球?qū)W院，廈門361005

鎘(cadmium，Cd)作為一種生物體非必需重金屬，痕量鎘就有可能對(duì)生物體產(chǎn)生毒害效應(yīng)，大部分動(dòng)物可同時(shí)從水體與食物2個(gè)途徑吸收Cd［1-2］，所以水相或食物相均有可能是動(dòng)物體Cd蓄積的主要來源，這取決于物種種類、金屬種類及餌料類型［3］。水生動(dòng)物體常通過鰓組織過濾大量海水，通過這種途徑溶解態(tài)重金屬得以在其體內(nèi)濃縮;另一方面，動(dòng)物體也可以通過攝食積累顆粒態(tài)重金屬，即通過營養(yǎng)傳遞在生物體內(nèi)蓄積［4-6］，如 Pierron 等［7］報(bào)道野外或室內(nèi)模擬狀態(tài)下營養(yǎng)傳遞均是Cd在歐洲鰻鱺(Anguilla anguilla)體內(nèi)積累的重要途徑。過去幾十年中，多數(shù)學(xué)者均是研究水環(huán)境中重金屬對(duì)生物體的毒性效應(yīng)［3-4］，然而越來越多的證據(jù)表明，食物相暴露不僅在重金屬積累方面有重要貢獻(xiàn)，同時(shí)在毒性方面也不容忽視［6］。如有研究發(fā)現(xiàn)，虹鱒(Oncorhynchusmykiss)在暴露于食物相Cd后生長速度下降［8］。但關(guān)于水相與食物相2種Cd暴露途徑對(duì)不同動(dòng)物體組織蓄積能力及毒性效應(yīng)的比較研究還較為少見，而這對(duì)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)的重新評(píng)估有重要意義［3］。

較多研究表明，腹足類動(dòng)物的金屬累積能力很強(qiáng)，是水體或沉積物污染重要的指示生物［9］，如Kang等［10］報(bào)道韓國昂山灣短玉黍螺(Littorina brevicula)體 Cd濃度達(dá)0．48～27．11 μg·g-1(以生物體干質(zhì)量計(jì))，且與海水中Cd濃度成正相關(guān)，因此可作為該海區(qū)Cd污染的指示物種;Daka等［11］的暴露實(shí)驗(yàn)表明，泥螺(Tympanotonus fuscatus)可以很好地指示Cd污染。方斑東風(fēng)螺(Babylonia areolata)分布廣，活動(dòng)范圍小，生命周期長，易采集，因此適合探索其作為重金屬污染的指示種的可行性。同時(shí)該螺又是正興起的優(yōu)良養(yǎng)殖種類，但近年來養(yǎng)成時(shí)大規(guī)模死亡時(shí)有發(fā)生，具體原因尚未探明，但海水污染包括重金屬毒性影響螺體正常生理活動(dòng)無疑是重要誘因之一。因此本實(shí)驗(yàn)擬在相同水體Cd濃度下，通過水體直接暴露與餌料預(yù)暴露后再攝食2種途徑，研究水相與食物相Cd暴露對(duì)螺組織Cd積累、MT誘導(dǎo)、肝胰臟脂質(zhì)過氧化水平、螺內(nèi)臟團(tuán)中Cd的亞細(xì)胞水平分布及凈化后螺組織中Cd排出的影響，以期闡明螺體Cd蓄積的主要途徑與毒性效應(yīng)，為該螺的健康養(yǎng)殖與安全食用提供理論指導(dǎo)，并可豐富海產(chǎn)腹足類的金屬毒理學(xué)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法(M aterials and methods)

1．1 實(shí)驗(yàn)材料

僧帽牡蠣(Saccostrea cucullata)，殼長6～7 cm，購自湛江市水產(chǎn)品批發(fā)市場，以下簡稱牡蠣，洗凈殼表附著生物后暫養(yǎng)于室內(nèi)。方斑東風(fēng)螺購自廣東湛江東海島養(yǎng)殖場，選取同池同批孵化幼體培育而成的個(gè)體，先在水簇箱中馴化2周，每天下午4∶00投喂1次新鮮牡蠣餌料，馴化攝食以1 h內(nèi)吃完為宜，將剩余餌料移走，臨實(shí)驗(yàn)前2 d停止投喂。

1．2 主要儀器與試劑

日本島津AA6800原子吸收分光光度計(jì)，美國OptimaL-100XP超速離心機(jī)，瑞士Polytron-PT-2100組織勻漿機(jī)，德國Centrifuge5810R高速冷凍離心機(jī)，美國Cary50紫外可見分光光度計(jì)。Cd元素標(biāo)準(zhǔn)物(1 000 mg·L-1)和扇貝成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(GBW10024)購自國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心;氯化鎘，純度99．9%，購自百靈威科技有限公司;福林-酚試劑、牛血紅蛋白、牛血清白蛋白和PMSF(苯甲基磺酰氟)購自生工生物工程(上海)股份有限公司;質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的磷酸二氫銨購自美國PerkinElmer儀器有限公司。

1．3 實(shí)驗(yàn)方法

預(yù)暴露牡蠣的獲得:在水族箱(0．58 m×0．45 m×0．35m)內(nèi)將僧帽牡蠣暴露于含Cd2+(100μg·L-1)的水體中，期間不投喂，連續(xù)充氧，自然光照。每隔2 d換1/3含相同Cd濃度的海水，并隨機(jī)取3只牡蠣測其軟體部Cd濃度，第14天達(dá)到平衡時(shí)結(jié)束，除取3只牡蠣供Cd濃度測定外，其余保存于-20℃作為餌料。

實(shí)驗(yàn)設(shè)水體Cd暴露(水相組)、餌料Cd暴露(食物相組)2個(gè)處理組，1個(gè)對(duì)照組，每組3個(gè)平行，每個(gè)平行1個(gè)水族箱，盛70 L自然砂濾海水，箱底鋪約5 cm厚的細(xì)沙。然后每箱放入活力好、規(guī)格相近的螺60只，海水溫度(27．1±0．5)℃，鹽度31．3，pH 值 7．9，溶氧 ＞6．5 mg·L-1。

水相組是將螺放入Cd2+濃度為100μg·L-1的水體，投喂牡蠣;食物相組是將螺放入清潔水體，投喂Cd預(yù)暴露的牡蠣。每天下午4:00按約6%螺質(zhì)量投喂1次，1 h后將殘餌移走并稱量質(zhì)量。30 d暴露結(jié)束后分別將水相組換成清潔砂濾海水、食物相組餌料換成天然牡蠣，進(jìn)入15 d凈化期。實(shí)驗(yàn)起始隨機(jī)取螺30只供各項(xiàng)指標(biāo)測定，然后分別于暴露第10、20、30天以及凈化第8、15天從各組各箱中隨機(jī)取9只，對(duì)照組同時(shí)取樣。將螺用雙蒸水沖洗，濾紙吸干，冰上解剖仔細(xì)分離出螺體鰓、胃腸道(胃與直腸)、肝胰臟、足肌4種組織，因胃腸道與鰓組織樣品量較少，所以Cd與MT含量測定是每箱3只螺取胃腸道混合作為1個(gè)樣品，每箱9只螺取鰓混合作為1個(gè)樣品;肝胰臟與足肌MT含量、肝胰臟MDA水平及螺內(nèi)臟團(tuán)中Cd的亞細(xì)胞分布測定均是每次每箱單只螺取樣，裝于聚乙烯樣品袋內(nèi)，液氮速凍后-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1．4 樣品測定

1．4．1 Cd 濃度測定

采用濕法消化法，螺組織樣品置80℃烘干至恒重，于三角燒瓶中按100 g·L-1加入 V(HNO3)∶V(HClO4)=4∶1混合液后，加蓋室溫靜置12 h，之后再加相同體積的混合酸，放置可控溫的電熱板上，在通風(fēng)櫥中溫度升至80℃，加熱2 h，然后升溫至110℃，保持微沸狀態(tài)，待棕色氣體冒盡，溶液澄清透明，繼續(xù)加熱至HClO4白煙冒盡后，消煮至近干，冷卻后用少量超純水淋洗三角瓶內(nèi)壁若干次，淋洗液一并移入50 mL容量瓶，并定容至標(biāo)線;同時(shí)制備樣品空白與扇貝成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW10024，適當(dāng)稀釋后用島津AA6800型原子吸收光譜儀測定，石墨爐法工作條件:波長228．8 nm;光譜帶寬0．5 nm;燈電流 8．0 mA;原子化程序:干燥 100℃、20 s，灰化600℃、20 s，原子化 1 850℃、3 s;基體改進(jìn)劑:1% 磷酸二氫銨(質(zhì)量分?jǐn)?shù))。水樣Cd濃度測定參照國標(biāo)GB17378．4 進(jìn)行。

1．4．2 MT 濃度測定

MT測定采用鎘/血紅蛋白飽和法，參照David和Brain［12］并略加改進(jìn)。樣品解凍后用雙蒸水洗去粘液，濾紙吸干后按250 g·L-1加入預(yù)冷勻漿緩沖液(20mmol·L-1Tris-HCl，pH=8;0．15mol·L-1NaCl;10 mmol·L-1β-巰基乙醇)，剪碎后用組織勻漿機(jī)冰浴勻漿，勻漿后于12 000×g、4℃離心15 min，分離出上清液。取上清液0．5 mL加入0．5 mL 1 mg·mL-1的Cd溶液，充分混合后室溫下孵育10 min，加入0．2 mL 20 g·L-1牛血紅蛋白混合，冰浴5 min后放入沸水浴中加熱2 min，冷卻后于10 000×g、4℃離心10 min;重復(fù)加牛血紅蛋白以后的步驟2次。取上清液加體積分?jǐn)?shù)為70%硝酸消化、定容，用石墨爐原子吸收光譜法測定Cd濃度。

MT分子量以6 500 Da計(jì)，因1 mol的MT可結(jié)合7 mol的Cd(原子量為112．4)，所以MT濃度(μg·g-1濕質(zhì)量)計(jì)算如下:

MT濃度(μg·g-1)=(CCd×S ×6500×V)/(G×7×112．4×N)

式中，CCd為定容液中 Cd的濃度(μg·mL-1)，S為定容體積(mL)，G為螺體軟組織濕質(zhì)量(g)，V為勻漿離心后的上清液體積(mL)，N為勻漿離心后的取樣體積(mL)。

1．4．3 Cd 的亞細(xì)胞分布測定

參照Wallace等的方法［13］，先分離出螺內(nèi)臟團(tuán)的5個(gè)亞細(xì)胞組分:富含金屬顆粒(metal rich granule，MRG)、細(xì)胞碎片(cellular debris)、細(xì)胞器(organelles)、熱敏感蛋白(heat sensitive protein，HSP)、類金屬硫蛋白(metallothionein like protein，MTLP)，測定各組分含Cd量，再計(jì)算各組分Cd含量占總體Cd含量的百分比。具體如下:將解凍后的樣品按250 g·L-1加入預(yù)冷勻漿液(20 mmol·L-1Tris-HCl，2 μmol·L-1PMSF，pH 8．0)，剪碎后用組織勻漿機(jī)冰浴勻漿5 min。然后4℃、1 500×g離心15 min。沉淀P1含有細(xì)胞碎片和組織碎片，上清液S1含有細(xì)胞器和可溶性組分。沉淀 P1用4 mL 1 mol·L-1NaOH重懸，60℃處理10 min，5 000×g離心獲得2個(gè)組分，分別是沉淀P2(MRG)和上清液S2。上清液S1經(jīng)4℃、100 000×g超速離心1 h，獲得沉淀P3和上清液S3(胞質(zhì)溶膠)。然后，上清液S3經(jīng)80℃熱處理10 min，冰浴1 h，在4℃、64 000×g高速離心10min，獲得沉淀P4(HSP)和上清液S4(MTLP)。操作中除了熱處理和離心外，樣品須始終處于冰浴中。各分離組分于80℃烘干、稱量質(zhì)量，測定Cd濃度，方法同上 1．4．1。

1．4．4 MDA 含量測定

MDA(malondialdehyde，丙二醛)含量測定采用TBA(thibabituric acid)法，每實(shí)驗(yàn)組測定3只螺的肝胰臟組織，解凍后按100 g·L-1加入預(yù)冷勻漿緩沖液(0．154 mol·L-1KCl，0．01 mol·L-1Tris-HCl，pH 7．4)，玻璃勻漿器冰浴中勻漿，勻漿液在4℃、10 000×g離心20 min，所得上清液根據(jù)需要稀釋2～10倍，采用試劑盒測定(購自南京建成生物工程研究所)，單位為nmol·mg-1。蛋白質(zhì)含量用福林-酚法測定，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)。

1．5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)形式給出;對(duì)百分率進(jìn)行反正弦平方根轉(zhuǎn)換，在進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)后，數(shù)據(jù)總體差異性用單因素方差分析(ANOVA)，當(dāng)差異顯著時(shí)，用Duncan＇s多重比較分析組間差異顯著性;用t-檢驗(yàn)分析對(duì)照組與處理組間差異;統(tǒng)計(jì)分析用SPSS13．0 軟件進(jìn)行，顯著水平為 P ＜0．05。

2 結(jié)果(Results)

2．1 水體與餌料中的Cd對(duì)螺生長參數(shù)的影響

水相組 Cd 濃度實(shí)測為(96．53 ±17．41)μg·L-1，對(duì)照組與食物相組的水體Cd濃度均很低，分別為(0．21 ±0．08)和(0．25 ±0．05)μg·L-1;對(duì)照組與水相組餌料牡蠣體內(nèi)的 Cd濃度為(0．92±0．07)μg·g-1，而食物相組的牡蠣體內(nèi)Cd濃度為(34．56±4．29)μg·g-1。如表1所示，各組螺在暴露與凈化實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)的平均殼長、濕質(zhì)量及攝食率間均無顯著差異(P＞0．05)，其中食物相組的攝食率略高，說明螺對(duì)Cd污染的牡蠣餌料沒有回避反應(yīng)。

2．2 螺各組織對(duì)Cd的蓄積

螺鰓、胃腸道、肝胰臟及足肌的Cd濃度變化如圖1所示?？梢姳┞镀陂g，第10天時(shí)水相組螺鰓中Cd 濃度(1．83 μg·g-1)即顯著高于對(duì)照組(0．62 μg·g-1)(P＜0．05)，其后迅速升高，第30天時(shí)為對(duì)照組的12．45倍;而食物相組Cd蓄積緩慢，但第30天時(shí)也顯著升高(P＜ 0．05)，為對(duì)照組的2．51倍(圖1A)。食物相組螺胃腸道中Cd濃度(10．45μg·g-1)在第10天時(shí)極顯著高于對(duì)照組(1．26μg·g-1)(P＜0．05)，但后期則逐漸下降，但第30天時(shí)仍顯著高于對(duì)照組(P＜ 0．05)，為對(duì)照組的7．05倍;水相組螺胃腸道中Cd積累較慢，第20天時(shí)也顯著高于對(duì)照組(P＜0．05)，第30天時(shí)上升為對(duì)照組的4．81倍(圖1B)。2個(gè)處理組螺的肝胰臟中Cd濃度在暴露期間均呈逐漸上升趨勢，第30天時(shí)分別達(dá)到7．65和9．37 μg·g-1，為對(duì)照組的 6．65 和 8．14 倍(圖1C)。而2個(gè)處理組螺的足肌Cd濃度在實(shí)驗(yàn)中與對(duì)照組間始終差異不顯著(P＞0．05)(圖1D)。進(jìn)入凈化期，除第8天時(shí)水相組螺的肝胰臟Cd濃度較暴露結(jié)束時(shí)高約4．71%外，其他均呈下降趨勢;第15天時(shí)除食物相組螺鰓中Cd濃度與對(duì)照組差異不明顯外(P＞0．05)，其余仍顯著高于對(duì)照組(P＜0．05)。

表1 Cd對(duì)方斑東風(fēng)螺的殼長、體質(zhì)量及攝食率的影響Table 1 Effect of Cd on shell length，total wetmass and feeding rates of B．a(chǎn)reolata

圖1 實(shí)驗(yàn)期間方斑東風(fēng)螺鰓(A)、胃腸道(B)、肝胰臟(C)和足肌(D)中Cd濃度變化Fig．1 Changes of Cd concentrations in gills(A)，gastrointestinal tract(B)，hepatopancreas(C)and footmuscle(D)of B．a(chǎn)reolata during experiment period

2．3 螺各組織MT的誘導(dǎo)量

表2所示為實(shí)驗(yàn)中螺的各組織MT含量變化?？梢?0 d水相暴露后，鰓中MT濃度較對(duì)照組顯著上升，第20天時(shí)進(jìn)一步升高，第30天時(shí)有所回落但仍顯著高于對(duì)照組(P＜0．05);食物相組螺鰓中MT濃度僅在第20天時(shí)顯著高于對(duì)照組(P＜0．05)，暴露

表2 實(shí)驗(yàn)期間方斑東風(fēng)螺鰓、胃腸道、肝胰臟和足肌中MT濃度Table 2 MT concentrations in tissues of gill，gastrointestinal tract，hepatopancreas and footmuscle of B．a(chǎn)reolata during experiment period(μg·g-1)

后期及凈化期內(nèi)均與對(duì)照組間無明顯差異(P＞0．05)。螺胃腸道中MT濃度在2個(gè)處理組中盡管有波動(dòng)，但與對(duì)照組間差異不顯著(P＞0．05)。而暴露期內(nèi)螺肝胰臟中MT濃度均持續(xù)上升，第20天時(shí)即顯著高于對(duì)照組(P＜0．05);2種途徑相比，水相組螺的MT含量始終高于相應(yīng)的食物相組;進(jìn)入凈化期，各組織MT含量均迅速下降至對(duì)照組水平(P＞0．05)。

因足肌中Cd蓄積與MT誘導(dǎo)量變化不明顯，故以胃腸道、鰓、肝胰臟組織中Cd濃度為自變量x、MT濃度為因變量y，綜合分析各組織中Cd含量與MT誘導(dǎo)量之間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)在胃腸道、鰓中兩者間無明顯相關(guān)性，而肝胰臟中兩者間呈顯著的線性正相關(guān):y=13．266x+56．221，r2=0．4733，P ＜ 0．05。

2．4 螺肝胰臟中MDA水平

表3所示為實(shí)驗(yàn)中螺的肝胰臟MDA水平?？梢姳┞对缙谑澄锵嘟M螺肝胰臟中MDA含量與對(duì)照組無顯著差別(P＞0．05)，第30天時(shí)較對(duì)照組顯著上升(P＜0．05);而水相組螺的肝胰臟MDA含量第10天即顯著高于對(duì)照組(P＜0．05)，且隨著暴露時(shí)間而上升。凈化期內(nèi)，食物相組第8天時(shí)MDA水平即回落至對(duì)照組狀態(tài)，而水相組仍顯著高于對(duì)照組(P＜0．05)，但第15天時(shí)與對(duì)照組間也無顯著差異(P＞0．05)。

表3 實(shí)驗(yàn)期間方斑東風(fēng)螺肝胰臟MDA含量Table 3 MDA concentrations in hepatopancreas of B．a(chǎn)reolata during experiment period(nmol·mg-1)

圖2 水相與食物相2種途徑Cd暴露30 d后再凈化15 d過程中方斑東風(fēng)螺內(nèi)臟團(tuán)中Cd的亞細(xì)胞分布變化Fig．2 Changes of subcellular Cd distribution in visceralmass of B．a(chǎn)reolata during 15 d depuration period after 30 d exposure to aqueous and dietary Cd

從圖2可見，MRG與細(xì)胞碎片亞細(xì)胞組分是螺內(nèi)臟團(tuán)Cd的主要儲(chǔ)存庫，因此Cd傾向結(jié)合在不可溶性組分中。實(shí)驗(yàn)中對(duì)照組螺各組分Cd的百分比保持穩(wěn)定狀態(tài)，相比對(duì)照組，水相暴露30 d后螺內(nèi)臟團(tuán)的細(xì)胞器、HSP和MTLP組分中Cd的百分比均有所上升，尤其HSP組分中Cd的百分比明顯上升;而細(xì)胞碎片中比例相應(yīng)下降，由對(duì)照組的21．9%減少至15．7%，同時(shí)MRG中Cd的百分含量也略有增加;食物相暴露后除MRG中Cd的百分比略有減少外，其余各組分的變化趨勢與水相組相似，但幅度較小，尤其是HSP中的百分比較對(duì)照組無明顯變化，但 MTLP中 Cd的百分比(20．1%)較水相組(18．4%)提高。凈化后，2種暴露途徑螺內(nèi)臟團(tuán)的細(xì)胞器與MTLP中Cd的百分比均有所下降，而MRG與細(xì)胞碎片中Cd的百分比略有上升;但HSP中Cd的百分比在水相組凈化后下降，但食物相組略有增加。

3 討論(Discussion)

3．1 螺各組織特異性Cd積累

本研究表明，Cd在螺各組織產(chǎn)生了特異性積累，如第10天食物相組螺胃腸道Cd濃度即顯著增加，但隨后呈下降趨勢，因此這種蓄積是短暫的;水相組螺胃腸道中Cd濃度也緩慢增加，說明螺為了維持滲透自穩(wěn)態(tài)而攝入海水也能在胃腸道中蓄積一定量的Cd。鰓是Cd進(jìn)入水生動(dòng)物體的主要位點(diǎn)與臨時(shí)貯存部位，但通過鰓分泌也是動(dòng)物排出體內(nèi)Cd的重要途徑［3］，因此最終鰓中Cd濃度取決于Cd吸收、分泌和轉(zhuǎn)移等這些過程相互作用的結(jié)果，實(shí)驗(yàn)中水相組螺鰓中Cd濃度迅速上升，這可歸因于鰓與水體直接接觸，通過頂細(xì)胞膜快速吸收溶解態(tài)Cd;食物相暴露后期(30 d)螺鰓中Cd濃度也顯著高于對(duì)照組，因食物中Cd泄漏至水體的量可忽略不計(jì)，推測可能是其他組織Cd通過基側(cè)細(xì)胞膜逐漸轉(zhuǎn)運(yùn)至鰓，通過鰓分泌而暫時(shí)在鰓中儲(chǔ)存的原因。螺肝胰臟中Cd的積累早期較慢，但隨暴露時(shí)間延長逐漸增加，第30天時(shí)2種途徑中均高于其他組織，表明胃腸道、鰓等組織吸收的Cd通過再分配轉(zhuǎn)移至肝胰臟［10］，因此肝胰臟是螺貯存Cd的主要器官。而Koyama等［14］也報(bào)道萊氏擬烏賊(Sepioteuthis lessoniana)在Cd 濃度為0．2mg·L-1水體中單獨(dú)暴露14 d，或經(jīng)過15 d的水體與餌料同時(shí)暴露后，其肝臟中Cd濃度與比例均最高。

除螺鰓中Cd濃度在水相暴露高于食物相外，其他3個(gè)組織均是從食物攝入高于水體，但鰓組織所占螺整體的比重極小，而胃腸道、肝胰臟與足肌所占螺體比重達(dá)80%以上，可見食物Cd的攝取對(duì)方斑東風(fēng)螺的重要性，原因可能是Cd在餌料牡蠣中以有機(jī)結(jié)合態(tài)存在，螺攝入后易經(jīng)消化系統(tǒng)吸收，而水體中Cd主以無機(jī)水合態(tài)離子存在，與除螺鰓外其他表皮細(xì)胞接觸后不易被吸收進(jìn)入血淋巴;Wang和Ke［15］用放射性同位素示蹤技術(shù)也得出攝食是波部東風(fēng)螺(Babylonia formosae)與小塔織紋螺(Nassarius teretiusculus)蓄積Cd的主要途徑;但Blackmore［16］報(bào)道疣荔枝螺(Thais clavigera)對(duì)污染餌料藤壺或貽貝的攝食量高于同種的無污染餌料，但56 d后個(gè)體間Cd濃度無顯著性差異，從而攝食不是該螺蓄積Cd的主要途徑;可見不同腹足類吸收與同化Cd的途徑存在差異。

3．2 螺組織中MT的表達(dá)

本研究中螺不同組織MT誘導(dǎo)表達(dá)量不同，可能與其不同組織中MT執(zhí)行不同的生理功能也有關(guān)，如 Dallinger等［17］報(bào)道陸生蝸牛(Helix pomatia)中腸腺M(fèi)T幾乎只含Cd，Zn和Cu含量甚微，外套膜MT卻主要結(jié)合Cu，表明中腸腺M(fèi)T基本功能是Cd解毒，而外套膜MT則主要參與血藍(lán)蛋白生物合成中的Cu調(diào)節(jié)作用。而螺肝胰臟中隨著Cd的蓄積，MT濃度也逐漸增加，與較多動(dòng)物相似，與該類蛋白結(jié)合是螺解除毒性的重要途徑［2］。但2種途徑相比，食物相組的螺肝胰臟MT表達(dá)量低于水相途徑，但Cd的蓄積更高，內(nèi)臟團(tuán)亞細(xì)胞組分MTLP中Cd的百分比也更高;Dang和Wang［18］也報(bào)道花身魚在水相與食物相Cd暴露處理后，亞細(xì)胞分布分析發(fā)現(xiàn)其肝臟中MT結(jié)合11% ～41%的Cd，而MTLP結(jié)合超過57%的Cd;本研究中螺對(duì)食物相Cd暴露的響應(yīng)可能與花身魚相似，即除MT外，還有其他類金屬硫蛋白擔(dān)負(fù)著Cd的螯合。另外，MT除了參與細(xì)胞內(nèi)Cd的螯合解毒外，在機(jī)體抗氧化方面也有重要的作用，如在哺乳動(dòng)物中，MT能夠清除因Cd暴露脅迫而產(chǎn)生的自由基，以修復(fù)細(xì)胞損傷［19］;實(shí)驗(yàn)中水相暴露時(shí)螺肝胰臟中MT濃度較高，可能也與其中更強(qiáng)的氧化脅迫反應(yīng)有關(guān)。

3．3 2種暴露途徑對(duì)螺毒性差異

實(shí)驗(yàn)中未觀察到螺的死亡現(xiàn)象，2個(gè)處理組螺的終末殼長、體質(zhì)量間均無明顯差異，可見不同暴露方式對(duì)螺的存活與生長未造成顯著影響。但一些生化水平指標(biāo)比監(jiān)測重金屬壓力的常規(guī)指標(biāo)具有更高敏感性，如脂質(zhì)過氧化(LPO)終產(chǎn)物丙二醛(MDA)常被用以監(jiān)測Cd對(duì)生物體的氧化脅迫狀態(tài)［20］。本研究水相組螺的肝胰臟MDA含量第10天即較對(duì)照組顯著上升，且始終高于同期的食物相組MDA水平，因此水相Cd暴露對(duì)螺肝胰臟造成的氧化損傷高于食物相。Company等［20］也報(bào)道深海熱液噴口的貽貝(Bathymofiolus azoricus)當(dāng)暴露于0．9 μmol·L-1水體Cd時(shí)，鰓組織出現(xiàn)顯著的脂質(zhì)過氧化，但當(dāng)暴露于食物相90μg·g-1的Cd時(shí)，則無脂質(zhì)過氧化作用產(chǎn)生，這表明相對(duì)水體Cd來說，食物相Cd毒性較低。因此，水相組較高的毒性可能是溶解態(tài)Cd經(jīng)螺鰓及表皮吸收后直接進(jìn)入螺血淋巴，不先經(jīng)肝胰臟生物轉(zhuǎn)化，故毒性較明顯;且Cd被轉(zhuǎn)運(yùn)至各器官組織后，部分被固定下來，不能全部到達(dá)肝胰臟;而經(jīng)螺胃腸道吸收的Cd可迅速通過門靜脈進(jìn)入肝胰臟，先經(jīng)不同程度化后才進(jìn)入血淋巴，這種作用機(jī)制可能與高等動(dòng)物相似［19］。

亞細(xì)胞分布研究是基于重金屬對(duì)生物體的毒性由蓄積于體內(nèi)金屬含量及在亞細(xì)胞水平分布決定的［21］，即進(jìn)入生物體內(nèi)的重金屬在亞細(xì)胞水平上與5個(gè)組分結(jié)合，其中MRG、細(xì)胞碎片、細(xì)胞器是細(xì)胞不可溶組分，HSP、MTLP是細(xì)胞可溶組分;同時(shí)細(xì)胞器與HSP又是金屬敏感組分，MTLP與MRG是金屬解毒組分，而細(xì)胞器、HSP與MTLP是能夠沿著食物鏈傳遞給攝食者組分，因此Cd的亞細(xì)胞分布研究有助于深入理解其在生物體細(xì)胞積累的具體位置與毒性［13］。從Cd在螺內(nèi)臟團(tuán)亞細(xì)胞組分中的分布來看，水相暴露30 d后，金屬敏感組分細(xì)胞器與HSP中Cd的結(jié)合百分比均有所上升，兩者之和由對(duì)照組的19．4%增加至23．1%;而食物相組只有細(xì)胞器中Cd的百分比小輻上升(0．4%)，可見水相組與金屬敏感組分結(jié)合比例較食物相組高，而金屬脫毒組分MTLP中Cd的百分比則是水相組(18．4%)低于食物相組(20．1%)，因此水相組螺肝胰臟細(xì)胞受損傷程度相對(duì)更大。

凈化后，2種途徑螺內(nèi)臟團(tuán)不可溶組分中Cd的百分比較暴露結(jié)束時(shí)均提高，水相組、食物相組分別由76．4%、75．3% 升至 80．8%、78．9%，表明 Cd 可能從其生物活性位點(diǎn)轉(zhuǎn)移到生物脫毒位點(diǎn)，因此螺對(duì)殘留于體內(nèi)Cd的解毒形式主要是與MRG、細(xì)胞碎片組分螯合蓄積于體內(nèi)，這與 Pan和 Wang［22］報(bào)道華貴櫛孔扇貝(Chlamys nobilis)對(duì)2種暴露途徑吸收的Cd在體內(nèi)去毒方式相似。而Choi等［23］報(bào)道南極帽貝(Laternula elliptica)在水體Cd 50μg·L-1暴露14 d后鰓中蓄積的Cd主要與細(xì)胞不可溶組分結(jié)合，而消化腺細(xì)胞中可溶胞液與不可溶顆粒結(jié)合的Cd相當(dāng)，因此兩組織采取的Cd解毒策略不同，導(dǎo)致不同物種及同一物種不同組織在亞細(xì)胞水平去毒機(jī)制上的差異。

3．4 凈化期螺各組織Cd排出率差異

本實(shí)驗(yàn)中螺經(jīng)15 d凈化后，各組織Cd排出率不同，水相暴露后高低順序?yàn)?鰓(78．43%)、胃腸道(19．41%)、足肌(16．67%)、肝胰臟(2．35%)，食物相則為:鰓(47．66%)、足肌(40．00%)、胃腸道(34．21%)、肝胰臟(15．37%);可看出螺組織在 Cd暴露時(shí)吸收越快，凈化時(shí)排出率也更高，如暴露結(jié)束時(shí)水相組螺鰓中Cd濃度是食物相組的5．74倍，凈化后水相組螺鰓的排出率(78．43%)遠(yuǎn)高于食物相組(47．66%);其余3組織中蓄積的Cd濃度均是食物相組較高，相應(yīng)的凈化時(shí)排出率也更高;同時(shí)也說明食物相Cd在螺凈化時(shí)易排出體外，而水相Cd則更容易蓄積在螺體內(nèi)，且水相組螺除鰓外各組織的排出率低于相關(guān)報(bào)道，如王凡等［24］報(bào)道染毒18 d櫛孔扇貝(C．farreri)放入清潔海水中，11 d凈化后，其鰓、肌肉和內(nèi)臟團(tuán)中Cd的排出率分別為65．41%、66．18%和38．11%;尤其是水相暴露后進(jìn)入凈化期第8天時(shí)，螺的肝胰臟中Cd濃度不但沒有降低，反而較暴露結(jié)束時(shí)上升4．71%，這說明短期凈化過程中，其他組織的Cd通過再分配進(jìn)入肝胰臟，這與Koyama等［14］報(bào)道的烏賊在水體Cd濃度為0．2mg·L-1中暴露14 d后移入清潔海水中凈化時(shí)，肝臟中Cd濃度在凈化第4天時(shí)反而較暴露結(jié)束時(shí)高相似。這種較低的排出率可歸因于Cd誘導(dǎo)螺體產(chǎn)生了大量的Cd-MT復(fù)合物，使Cd被貯存在螺體內(nèi)，從而增加了營養(yǎng)傳遞時(shí)Cd的生物可利用性，因此，Cd在腹足類體內(nèi)的高度蓄積必須引起人們的重視，尤其是在螺類等海鮮食物深受人們喜愛的沿海地區(qū)［25］。

［1］ 范文宏，段勇，林爽，等．水體沉積物結(jié)合態(tài)鎘對(duì)大型溞(Daphniamagna)的生物毒性研究［J］．生態(tài)毒理學(xué)報(bào)，2009，4(4):544-551 Fan W H，Duan Y，Lin S，etal．The biotoxicity of cadmium associated with fresh-water sediment to the Daphniamagna［J］．Asian Journal of Ecotoxicology，2009，4(4):544-551(in Chinese)

［2］ 張高川，張春華，葛瀅．鎘脅迫下蚯蚓金屬硫蛋白氧化修飾的研究［J］．生態(tài)毒理學(xué)報(bào)，2010，5(4):558-562 Zhang G C，Zhang CH，Ge Y．Oxidativemodification of metallothionein in earthworm under Cd stress［J］．Asian Journal of Ecotoxicology，2010，5(4):558-562(in Chinese)

［3］ Wang W X，F(xiàn)isher N S．Delineatingmetalaccumulation pathways for marine invertebrates［J］．Science of the Total Environment，1999，237-238:459-472

［4］ BaudrimontM，Andres S，Durrieu G，et al．The key role ofmetallothioneins in the bivalve Corbicula fluminea during the depuration phase after in situ exposure to Cd and Zn［J］．Aquatic Toxicology，2003，63(2):89-102

［5］ Xu Y，Wang W X．Exposure and potential food chain transfer factor of Cd，Se and Zn in marine fish Lutjanus argentimaculatus［J］．Marine Ecology Progress Series，2002，238:173-186

［6］ Seebaugh D R，Daisuke G，WallaceW G．Bioenhancement of cadmium transfer along a multi-level food chain［J］．Marine Environmental Research，2005，59(5):473-491

［7］ Pierron F，Baudrimont M，Lucia M，et al．Cadmium uptake by the European eel:Trophic transfer in field and experimental investigations［J］．Ecotoxicology and Environmental Safety，2008，70(1):10-19

［8］ Ng T Y T，Wood CM．Trophic transfer and dietary toxicity of Cd from the oligochaete to the rainbow trout［J］．Aquatic Toxicology，2008，87(1):47-59

［9］ Rainbow P S．Biomonitoring of heavy metal availability in themarine environment［J］．Marine Pollution Bulletin，1995，31(4-12):183-192

［10］ Kang SG，ChoiM S，Oh IS，etal．Assessmentofmetal pollution in Onsan Bay，Korea using Asian periwinkle Littorina brevicula as a biomonitor［J］．Science of the Total Environment，1999，234(1-3):127-137

［11］ Daka E R，Oweisana I I，Braide SA．Accumulation of heavymetals from single and mixed metal solutions by the gastropod mollusc Tympanotonus fuscatus linnaeus from a Niger Delta estuary:Implications for biomonitoring［J］．African Journal of Biotechnology，2006，5(20):1954-1962

［12］ David L E，Brain F T．Evaluation of the Cd/hemoglobin affinity assay for the rapid determination ofmetallothionein in biological tissues［J］．Toxicology and Applied Pharmacology，1982，66(1):134-142

［13］ WallaceW G，Lee BG，Luoma SN．Subcellular compartmentalization of Cd and Zn in two bivalves．I．Significance ofmetal-sensitive fractions(MSF)and biologically detoxified metal(BDM)［J］．Marine Ecology Progress Series，2003，249:183-197

［14］ Koyama J，Nanamori N，Segawa S．Bioaccumulation of waterborne and dietary cadmium by oval squid，Sepioteuthis iessoniana ，and its distribution among organs［J］．Marine Pollution Bulletin，2000，40(11):961-967

［15］ Wang W X，Ke C H．Dominance of dietary intake of cadmium and zinc by two marine predatory gastropods［J］．Aquatic Toxicology，2002，56(3):153-165

［16］ Blackmore G．Field evidence ofmetal transfer from invertebrate prey to an intertidal predator，Thais clavigera(Gastropoda:Muricidae)［J］．Estuarine，Coastal and Shelf Science，2000，51(2):127-139

［17］ Dallinger R，Berger B，Hunziker P，et al．Structure and Function of Metallothionein Isoforms in Terrestrial Snails［M］．Klaassen CD．Metallothionein IV．Basel:Birkhauser Verlag，1999:173-178

［18］ Dang F，Wang W X．Assessment of tissue-specific accumulation and effects of cadmium in amarine fish fed contaminated commercially produced diet［J］．Aquatic Toxicology，2009，95(3):248-255

［19］ 印木泉．遺傳毒理學(xué)［M］．北京:科學(xué)出版社，2002:55-70

［20］ Company R，Serafim A，Bebianno M J，et al．Effect of cadmium，copper and mercury on antioxidant activities and lipid peroxidation in the gills of the hydrothermal ventmussel Bathymodiolus azoricus［J］．Marine Environmental Research，2004，58(2-5):377-381

［21］ Wang W X，Rainbow P S．Subcellular partitioning and the prediction of cadmium toxicity to aquatic organisms［J］．Environmental Chemistry，2006，3(6):395-399

［22］ Pan K，Wang W X．The subcellular fate of cadmium and zinc in the scallop Chlamys nobilis during waterborne and dietarymetal exposure［J］．Aquatic Toxicology，2008，90(4):253-260

［23］ Choi H J，Ji J，Chung K H，et al．Cadmium bioaccumulation and detoxification in the gill and digestive gland of the Antarctic bivalve Laternula elliptica［J］．Comparative Biochemistry and Physiology Part C:Toxicology＆ Pharmacology，2007，145(2):227-235

［24］ 王凡，趙元鳳，吳益春，等．櫛孔扇貝對(duì)Cd的累積和排出［J］．湛江海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，25(4):95-98

［25］ 王文雄，潘進(jìn)芬．重金屬在海洋食物鏈中的傳遞［J］．生態(tài)學(xué)報(bào)，2004，24(3):599-604 Wang W X，Pan J F．The transfer of metals in marine food chains:A review ［J］．Acta Ecologica Sinica，2004，24(3):599-604(in Chinese) ◆