氯化鎘對斑馬魚胚胎的發(fā)育毒性

魯疆，王占洋，袁玉婷，許波，高永林，張波，鄭秋生，，王振華，，*

1．石河子大學(xué)藥學(xué)院新疆特種植物藥資源教育部重點實驗室，石河子832002

2．煙臺大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，煙臺264005

鎘(Cd)是一種常見的環(huán)境毒物，目前發(fā)現(xiàn)其對人體沒有任何生理作用。Cd的生物半衰期長達10～35 y，可在體內(nèi)長期蓄積產(chǎn)生毒性。Cd污染不僅影響農(nóng)作物的生長發(fā)育、產(chǎn)品及質(zhì)量，還通過食物鏈的形式在動物和人類體內(nèi)大量蓄積，危害動物和人類的健康及生命安全。Cd可以對人體肝、腎、骨骼、及生殖等多個系統(tǒng)產(chǎn)生毒害作用。妊娠期的婦女接觸Cd，不僅會受到Cd的毒性作用，而且Cd可以透過胎盤屏障損害胎兒神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育，導(dǎo)致胎兒發(fā)育不良，新生兒體質(zhì)量下降。1971年國際環(huán)境會議將Cd列為環(huán)境污染物中最危險的5種物質(zhì)之一。隨著工業(yè)化進程的加速，Cd暴露對人類健康的影響日益引起人們的關(guān)注［1-2］。我國目前至少有16個省(自治區(qū)、直轄市)報導(dǎo)過職業(yè)或環(huán)境Cd暴露對健康的不良影響。因而，開展Cd毒性研究具有巨大的現(xiàn)實意義和社會價值。大量實驗表明，Cd的毒性機制與細胞受氧化脅迫相關(guān)［3-4］。氧化應(yīng)激誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化，是魚類暴露Cd后眾所周知的生物學(xué)效應(yīng)［5-7］。Stohs和Bagchi研究表明［8］，Cd誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗氧化狀態(tài)的變化，可能通過提高超氧陰離子自由基的產(chǎn)生和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，也有可能減少酶和非酶的抗氧化劑。Cd很可能觸發(fā)氧化還原反應(yīng)，產(chǎn)生自由基和活性氧(ROS)(包括 H2O2、O-2·、·OH 等)，ROS 的積累會損傷DNA、蛋白質(zhì)和脂類［3］。ROS在信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控中發(fā)揮著重要作用［9］。適量的ROS很可能作為第二信使激活轉(zhuǎn)錄因子NF-kappa-B，但高濃度的ROS會損傷組織［10］。在正常情況下，ROS和其他自由基會被抗氧化系統(tǒng)、抗氧化物酶(CAT、SOD、GPx、GST等)及非酶的抗化劑(GSH)清除［11-13］。如果ROS的量超過了抗氧化系統(tǒng)的防御能力，氧化應(yīng)激會導(dǎo)致魚類組織細胞多種類型的損傷［14］。近期，大量研究開始關(guān)注Cd暴露后氧化應(yīng)激對魚類的影響［15-17］。胡蓉等［18］研究表明，Cd2+、Hg2+對鯽魚胚胎發(fā)育和仔魚均有毒害作用，且隨Cd2+、Hg2+質(zhì)量濃度的增大和染毒時間的延長，毒性效應(yīng)不斷增加。研究表明，Cd積累及其毒性效應(yīng)會影響日本比目魚的生長和抗氧化系統(tǒng)，減少中國沿海水域商業(yè)魚類數(shù)量。Chow等［19］2008年研究表明，Cd誘導(dǎo)斑馬魚胚胎神經(jīng)毒性抑制神經(jīng)形成，從而減少神經(jīng)元分化和軸突形成。Chow等［20］2009年研究表明，Cd暴露斑馬魚胚胎幼魚眼視網(wǎng)膜分化細胞減少，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞軸突形成受損和視錐細胞缺乏，是引起眼球和視力受損的主要原因。Cd暴露后，魚類將啟動多種酶類和非酶的抗氧化機制來抵御氧化應(yīng)激。例如，超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、還原型谷胱甘肽(GSH)及谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)，它們可以解除重金屬暴露的毒性作用，清除ROS，從而預(yù)防魚類受氧化損傷［21-22］。

斑馬魚(Danio rerio)是已經(jīng)被人們廣泛接受并用于研究胚胎發(fā)育，遺傳分析，毒理學(xué)和多種人類疾病的理想模式生物［23-24］。經(jīng)濟合作與發(fā)展組織(OECD)在1996年將斑馬魚胚胎發(fā)育的方法列為測定單一化學(xué)毒物的標(biāo)準(zhǔn)方法之一，并制定了詳細的操作指南［25］。運用斑馬魚檢驗環(huán)境化學(xué)物的致畸效應(yīng)，具有成本低、影響因素少、可重復(fù)性好、易操作、靈敏度高以及可觀察多項毒性指標(biāo)的特點，并可以此判斷污染物的致毒機理。

近些年來，國內(nèi)外大量研究報道了Cd毒性在實驗動物肝、腎、骨骼及神經(jīng)系統(tǒng)中與金屬硫蛋白［26-27］、鈣［28］、線粒體［29］及誘導(dǎo)氧化脅迫［30］的作用機理。但是關(guān)于Cd對胚胎發(fā)育的毒性及機制的相關(guān)報道極為少見，然而關(guān)于Cd誘導(dǎo)氧化應(yīng)激對斑馬魚胚胎發(fā)育的影響仍未見報道。以斑馬魚為實驗動物考察了氯化鎘對斑馬魚胚胎發(fā)育的毒性作用，并初步探討了氧化脅迫與Cd毒性的相關(guān)性，為進一步深入研究Cd發(fā)育毒性以及合理的臨床干預(yù)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法(M aterials and m ethods)

1．1 材 料

AB系斑馬魚成魚由國家斑馬魚模式動物北方中心惠贈，由本實驗室繁育保存。

E3 培養(yǎng)液含 0．17mmol·L-1KCl，5mmol·L-1NaCl，0．33mmol·L-1MgSO4，0．33mmol·L-1CaCl2，pH 7．4。

CdCl2純度為99．0%，上海中秦化學(xué)試劑公司;丙二醛(MDA)測定試劑盒，南京建成生物工程研究所;GSH和GSSG檢測試劑盒均為碧云天生物技術(shù)研究所;N-乙酰半胱氨酸(NAC)，麻醉劑Tricaine和活性氧熒光探針DCFH-DA均購自美國SIGMA公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1．2 方 法

1．2．1 魚卵的收集

成年斑馬魚飼養(yǎng)于獨立養(yǎng)殖單元(北京愛生)，水溫(28．5±0．3)℃，鹽度為450～500 μS，pH為7．0 ～7．5，光周期為14 h/10 h(光照/黑暗)，每日喂3次活豐年蝦。在收集胚胎的前一天晚，將1條雌魚和1條雄魚移入交配盒，用隔板將其隔開，第2天光照1 h后移去隔板，觀察產(chǎn)卵時間。于產(chǎn)卵后1 h收集受精卵，用E3培養(yǎng)液輕輕沖洗3次后，置于E3培養(yǎng)液中，28．5℃恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1．2．2 胚胎染毒實驗

參照Vaughan等［31］的方法，收集受精后1 h(1 hpf)斑馬魚胚胎置于12孔細胞培養(yǎng)板中，10卵/孔，每孔加入2．0mL含不同濃度CdCl2的E3培養(yǎng)液，每處理組設(shè)胚胎80枚，另取80枚卵孵育于不含CdCl2的E3培養(yǎng)液作為正常對照。隨后加蓋封閉，置于28．5℃恒溫光照培養(yǎng)箱內(nèi)，讓胚胎繼續(xù)發(fā)育。每24 h更換一半E3培養(yǎng)液，并觀察胚胎發(fā)育狀況，至96 hpf。以卵凝結(jié)或心臟停跳作為胚胎死亡終點，記錄胚胎和/或幼魚的死亡、畸形及幼魚孵化情況，計算死亡率、孵化率和畸形率:胚胎死亡率(%)=(死亡胚胎數(shù)量/總胚胎數(shù)量)×100;胚胎孵化率=(孵化的胚胎總數(shù)/總胚胎數(shù)量)×100;畸形率(%)=(畸形幼魚數(shù)量/已孵化胚胎數(shù)量)×100。

1．2．3 NAC 干預(yù)實驗

按1．2．2胚胎染毒方法，取1 hpf胚胎，胚胎暴露于含20mg·L-1CdCl2，或同時含有20mg·L-1CdCl2和10 mg·L-1NAC，或含有10mg·L-1NAC 的E3 培養(yǎng)液，同時設(shè)空白對照組。以卵凝結(jié)或心臟停跳作為死亡終點，在體式顯微鏡下觀察至96 hpf，記錄胚胎和/或幼魚的死亡數(shù)、畸形數(shù)及幼魚的孵化數(shù)，計算死亡率、畸形率和孵化率。

1．2．4 胚胎細胞凋亡觀察

參照文獻［32］的方法，收集1 hpf斑馬魚胚胎，按1．2．3 方法處理至24 hpf，更換為含5 mg·L-1吖啶橙(AO)的 E3培養(yǎng)液，28．5℃孵育 20 min，以不含AO的E3培養(yǎng)液洗滌3次，每次5 min，加入含0．016 mol·L-1Tricaine的 E3培養(yǎng)液處理1 min，麻醉胚胎后，在熒光顯微鏡(日本Nikon ECLIPSE 80i)下以藍光激發(fā)，觀察胚胎細胞凋亡情況并拍照。

1．2．5 胚胎活性氧水平測定

按1．2．3方法處理1 hpf胚胎3 h，E3培養(yǎng)液清洗胚胎3次后，更換為含20μmol·L-1DCFH-DA的E3培養(yǎng)液，于28．5℃孵育1 h，以E3培養(yǎng)液洗滌胚胎3次，吸凈E3培養(yǎng)液，每處理選取20枚胚胎，加入預(yù)冷的200μL E3培養(yǎng)液后，電動組織勻漿器勻漿，勻漿液于4℃、10 000 g下離心4 min，取200μL上清液，加入96孔酶標(biāo)板，于酶標(biāo)儀(瑞士 Tecan Infinite M200，)測定熒光強度(激發(fā)波長485 nm，發(fā)射波長535 nm)。

1．2．6 MDA 含量測定

按1．2．3方法處理1 hpf胚胎3 h，每處理取胚胎20枚，轉(zhuǎn)移到離心管中，以E3培養(yǎng)液洗滌胚胎3次，吸干表面液體，加入200μL E3培養(yǎng)液，電動組織勻漿器勻漿，勻漿液于4℃、10 000 g下離心10 min。取上清，按試劑盒說明書方法測定MDA含量。

1．2．7 GSH、GSSG 指標(biāo)測定

按1．2．3方法處理1 hpf胚胎3 h，每處理取20枚胚胎，轉(zhuǎn)移到1．5 mL離心管中，冰浴E3培養(yǎng)液洗滌3次，吸干表面液體，勻漿，4℃放置10min，4℃、10 000 g下離心10 min，取上清按照試劑盒說明書測定GSH和GSSG值。

1．2．8 統(tǒng)計學(xué)分析

所有實驗均重復(fù)3次。實驗數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，除特別說明外，結(jié)果均采用SAS 8．1統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，P＜0．05表示差異具有顯著性統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果(Results)

2．1 氯化鎘對斑馬魚胚胎發(fā)育的毒性效應(yīng)

圖1 氯化鎘對斑馬魚胚胎的毒性效應(yīng)Fig．1 Toxic effects of CdCl2 on zebrafish embryos

斑馬魚胚胎于54 hpf開始孵化出膜，對照組至78 hpf孵化完全。10 ～30mg·L-1CdCl2處理后，斑馬魚胚胎孵化率降低，死亡率升高，呈濃度依賴性。30 mg·L-1CdCl2處理組至 96 hpf時胚胎死亡率達98．3%，且未有胚胎孵化。各組斑馬魚胚胎死亡均發(fā)生于24 hpf之前。采用線性回歸分析法計算出CdCl2處理至96 hpf對斑馬魚胚胎的半數(shù)致死濃度(LC50)為 18．9 mg·L-1(R2=0．973)。

2．2 氯化鎘對斑馬魚胚胎發(fā)育的致畸作用

10～25 mg·L-1CdCl2暴露對斑馬魚胚胎及幼魚多個系統(tǒng)的發(fā)育產(chǎn)生明顯影響，主要表現(xiàn)為魚卵發(fā)育阻滯、心臟水腫、卵黃囊水腫和脊柱彎曲等多種發(fā)育異常(圖3)。10～25 mg·L-1CdCl2處理后，幼魚心臟水腫、脊柱彎曲及總畸形率升高(圖2，圖3)。采用線性回歸分析法計算出CdCl2處理至96 hpf對斑馬魚胚胎的半數(shù)致畸濃度(EC50)為13．7 mg·L-1(R2=0．967)。

圖2 氯化鎘致斑馬魚胚胎的發(fā)育畸形率Fig．2 Developmentalmalformation rate of zebrafish embryos induced by CdCl2

圖3 氯化鎘致斑馬魚胚胎發(fā)育的典型畸形特征

2．3 抗氧化劑NAC對氯化鎘發(fā)育毒性的干預(yù)作用

與對照組比較，20 mg·L-1CdCl2單獨處理斑馬魚胚胎，致胚胎死亡率(圖4)和畸形率(圖5)均明顯增加(P ＜0．01);采用 10 mg·L-1NAC 與 20 mg·L-1CdCl2聯(lián)合處理斑馬魚胚胎，與單純CdCl2處理組相比，胚胎死亡率(圖4)和畸形率(圖5)均明顯降低(P ＜0．01)。與對照組比較，20 mg·L-1CdCl2單獨處理斑馬魚幼魚體長(圖6)明顯縮短(P＜0．05);采用10 mg·L-1NAC 與 20 mg·L-1CdCl2聯(lián)合處理斑馬魚胚胎，與單純氯化鎘處理組相比，斑馬魚幼魚體長(圖6)明顯增長(P＜0．05)。表明NAC對CdCl2所致的斑馬魚胚胎發(fā)育毒性有一定保護作用。

圖4 NAC干預(yù)氯化鎘對斑馬魚胚胎的毒性效應(yīng)Fig．4 NAC intervened toxic effect of CdCl2 on zebrafish embryos

2．4 氯化鎘導(dǎo)致斑馬魚胚胎細胞的異常凋亡

圖5 NAC干預(yù)氯化鎘致斑馬魚胚胎的總畸形率Fig．5 NAC intervened total aberation rate of zebrafish embryos caused by CdCl2

圖6 NAC干預(yù)氯化鎘對斑馬魚胚胎體長的影響Fig．6 NAC intervened short snout-vent length of zebrafish embryos caused by CdCl2

斑馬魚胚胎經(jīng)吖啶橙染色后，凋亡細胞呈現(xiàn)亮綠色熒光。正常組胚胎卵黃囊部位可見大量深染凋亡細胞，其他部位僅見少量深染細胞(圖7A)。20mg·L-1CdCl2處理后，除卵黃囊部位見大量深染細胞外，頭部和尾部亦可見大量深染細胞(圖7B)，表明CdCl2處理可能對中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育有一定影響。采用10 mg·L-1NAC 與20 mg·L-1CdCl2聯(lián)合處理斑馬魚胚胎后，僅見少量凋亡細胞(圖7C)，表明NAC對CdCl2誘導(dǎo)的斑馬魚胚胎細胞凋亡有明顯的抑制作用。

圖7 氯化鎘對斑馬魚胚胎細胞凋亡的影響

2．5 氯化鎘暴露導(dǎo)致斑馬魚胚胎氧化脅迫損傷

20mg·L-1CdCl2處理斑馬魚胚胎后，胚胎ROS水平(圖8A)、胚胎脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)水平(圖8B)均明顯高于對照組(P ＜0．01)，GSH/GSSG 水平明顯低于對照組(P＜0．01)(圖8C)，表明CdCl2處理致斑馬魚胚胎發(fā)生了氧化應(yīng)激損傷。采用10 mg·L-1NAC與20mg·L-1CdCl2共同處理斑馬魚胚胎，可明顯下調(diào)胚胎組織中ROS和MDA水平(P＜0．05)(圖8A和B)，上調(diào) GSH/GSSG 水平(P ＜0．05)(圖8C)，表明NAC對CdCl2所致斑馬魚胚胎氧化應(yīng)激損傷有一定防護作用。

3 討論(Discussion)

Cd是一種強的脂質(zhì)過氧化作用誘導(dǎo)劑，脂質(zhì)過氧化作用可導(dǎo)致細胞膜通透性增強，造成細胞內(nèi)外的穩(wěn)態(tài)失調(diào)，從而引起一系列損害。Cd能夠降低肝臟中谷胱甘肽含量，有效抑制POD、SOD和CAT活性，改變細胞內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)，使自由基不能及時被清除，造成機體內(nèi)大量自由基積累。GSH在清除細胞內(nèi)H2O2、O-2·和LOOH中扮演了重要角色，同時GST能夠催化外源性毒物與GSH反應(yīng)結(jié)合，以保護組織不受氧化脅迫損傷［33］。大量的 ROS會激活caspase依賴型途徑，誘導(dǎo)細胞凋亡。而NAC作為抗氧化劑易進入細胞，脫乙?；蟪蔀楣入赘孰那绑w，能促進還原型谷胱甘肽的合成，而谷胱甘肽氧化-還原循環(huán)在機體內(nèi)具有許多功能，是組織抗氧化損傷的重要內(nèi)源性防御機制。

圖8 氯化鎘對斑馬魚胚胎氧化脅迫狀態(tài)的影響Fig．8 Effect of CdCl2 on oxidative stress status of zebrafish embryos

本研究表明，斑馬魚胚胎暴露于CdCl296 h后，胚胎的死亡率、畸形率均明顯升高，CdCl2處理可致胚胎凋亡細胞明顯增多，幼魚體型短小。幼魚頭部和尾部可見大量細胞凋亡，表明CdCl2處理可能對中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育有一定影響。Krumschnabel等［34］-12010年研究發(fā)現(xiàn)，Cd可以誘導(dǎo)虹鱒魚細胞壞死性凋亡。Risso-de Faverney等［35］2004 年研究表明，Cd通過線粒體途徑誘導(dǎo)虹鱒魚肝細胞氧化脅迫，進而導(dǎo)致細胞凋亡。Chen等［36］研究發(fā)現(xiàn)，Cd誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生，進而激活雷帕霉素(mTOR)信號通路，活化胰島素生長因子受體(IGFR/PI3K)，抑制腺苷酶活化蛋白激酶(PTEN/AMPK)，導(dǎo)致神經(jīng)細胞凋亡。Long等［37］研究發(fā)現(xiàn)，ABCC5/MRP5 是一種有機陰離子載體，參與機體防御和細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。ABCC5在斑馬魚胚胎發(fā)育和解除重金屬(Cd、Pb等)毒性中扮演了重要角色。顯性失活的ABCC5會引起斑馬魚胚胎發(fā)育阻滯，而Cd、Pb和Hg等重金屬暴露致斑馬魚胚胎 ABCC5表達上調(diào)。本研究中，較CdCl2的單獨處理組，NAC與CdCl2共同處理組中斑馬魚幼魚體長明顯增長，活性氧水平和MDA含量明顯降低。這說明，Cd導(dǎo)致斑馬魚胚胎發(fā)育阻滯，可能與ROS誘導(dǎo)ABCC5表達相關(guān)。進一步研究表明，CdCl2染毒可致斑馬魚胚胎ROS水平和脂質(zhì)過氧化水平明顯升高，降低 GSH/GSSG比率，證實CdCl2暴露可致胚胎發(fā)生嚴重的氧化應(yīng)激損傷。細胞的正常代謝可產(chǎn)生各種ROS，過多的ROS會導(dǎo)致這一生理平衡失調(diào)，可引起細胞的氧化應(yīng)激、蛋白質(zhì)變性、脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物 MDA增加以及 DNA斷裂［38-41］;MDA為體內(nèi)脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，GSH是體內(nèi)含巰基的非蛋白化合物，具有保護酶分子和蛋白質(zhì)免受內(nèi)源或外源性氧化損傷，二者是評價細胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的重要指標(biāo)。CdCl2可造成斑馬魚胚胎氧化應(yīng)激，影響胚胎正常發(fā)育，甚至造成死亡。應(yīng)用抗氧化劑NAC可明顯拮抗CdCl2的發(fā)育毒性，胚胎孵化率顯著升高，畸形率明顯降低，胚胎凋亡細胞也明顯減少，幼魚體型增長;與氧化脅迫相關(guān)的胚胎ROS和MDA明顯降低，而GSH/GSSG比值明顯升高。以上數(shù)據(jù)表明，抗氧化劑NAC可以有效保護Cd暴露造成斑馬魚胚胎的發(fā)育毒性，進一步表明CdCl2對斑馬魚胚胎的發(fā)育毒性作用與氧化應(yīng)激相關(guān)。Hsu等［42］近期發(fā)現(xiàn)，斑馬魚胚胎暴露于Cd中可致Cu/Zn超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)基因表達下調(diào)，進一步影響DNA錯配修復(fù)基因的表達。然而，生物體內(nèi)氧化還原平衡狀態(tài)的調(diào)控依賴一套復(fù)雜的ROS生成和清除系統(tǒng)，Cd暴露是否僅僅作用于ROS清除系統(tǒng)，又或者也作用于ROS生成系統(tǒng)，尚待更完善的研究以揭示。

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