氯化鎘暴露對(duì)斑馬魚幼魚神經(jīng)行為毒性作用

史慧勤，張利軍，苑曉燕，彭輝，趙君，彭雙清

軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院疾病預(yù)防控制所毒理學(xué)評(píng)價(jià)研究中心，北京100071

鎘是一種重要的環(huán)境重金屬污染物，由吸入含鎘的煙霧和灰塵引起急性鎘中毒歷來是危害公共衛(wèi)生安全的重要事件，而對(duì)食品安全問題的擔(dān)憂使得人們更加重視水源、可食水生生物以及農(nóng)作物中鎘污染的問題。鎘具有蓄積性，可造成肝、腎、骨骼等全身多臟器的損傷［1-2］，并且可透過胎盤影響胎兒，因而對(duì)出生前后低劑量鎘暴露引起的發(fā)育障礙尤其是對(duì)胎兒和嬰幼兒神經(jīng)發(fā)育方面影響也廣受關(guān)注。臨床研究認(rèn)為，胎兒期慢性鎘暴露能夠抑制神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育并引起嬰幼兒認(rèn)知功能障礙以及感覺運(yùn)動(dòng)能力減弱、多動(dòng)癥和注意力障礙等［3-5］。兒童期體內(nèi)鎘負(fù)荷量增高可造成精神運(yùn)動(dòng)性發(fā)育障礙，損害感知覺能力、語言能力并造成智力下降［3-4］。嚙齒動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，出生前后低水平的鎘暴露會(huì)影響小鼠電生理學(xué)功能和高級(jí)神經(jīng)系統(tǒng)功能［6］。另外，低劑量長(zhǎng)期染毒會(huì)減少海馬CA3區(qū)神經(jīng)元和反應(yīng)性增多星型神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，導(dǎo)致小鼠學(xué)習(xí)、記憶能力降低［7］。小鼠胎仔宮內(nèi)鎘暴露后，出現(xiàn)劑量依賴性的獲得性條件回避反射能力損害及異常行為表現(xiàn)，并在發(fā)育至成年后具有遠(yuǎn)期行為損害效應(yīng)［8-9］。

斑馬魚具有典型的脊椎動(dòng)物腦部形態(tài)特征，并且分子遺傳學(xué)和發(fā)育生物學(xué)背景明確，已被廣泛應(yīng)用于毒理學(xué)神經(jīng)發(fā)育研究［10］。Chow 等［11］研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)育早期鎘暴露能夠抑制斑馬魚胚胎的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化，導(dǎo)致胚胎頭部發(fā)育不良，神經(jīng)前體基因表達(dá)降低，進(jìn)而證實(shí)鎘通過損害斑馬魚神經(jīng)細(xì)胞生成，導(dǎo)致神經(jīng)分化顯著降低和軸突形成減少來發(fā)揮神經(jīng)發(fā)育毒性作用。斑馬魚的神經(jīng)組織和器官結(jié)構(gòu)雖然簡(jiǎn)單但能夠支配復(fù)雜行為活動(dòng)，如逃避、捕食、群體交互及學(xué)習(xí)、記憶等［12-13］。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了發(fā)育早期階段經(jīng)過低劑量鎘長(zhǎng)時(shí)間暴露的斑馬魚幼魚的運(yùn)動(dòng)行為特征，目的是為探索應(yīng)用高通量的神經(jīng)行為學(xué)方法檢測(cè)水環(huán)境中鎘污染和提高斑馬魚幼魚作為神經(jīng)發(fā)育毒理學(xué)模型的應(yīng)用效能提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法(M aterials and methods)

1．1 主要試劑及配制

氯化鎘(cadmium chloride)(99．0%)，北京化工廠。幼魚孵化液(30%Danieau＇s 液):17．4 mmol·L-1NaCl、0．21 mmol·L-1KCl、0．12 mmol·L-1MgSO4、0．15 mmol·L-1Ca(NO3)2、1．5mmol·L-1Hepes(pH 7．2)。參照文獻(xiàn)［11，14］，用幼魚孵化液配制0．5 ～2．0 μmol·L-1的氯化鎘受試液和0．5% ～4%乙醇溶液。亞甲基藍(lán)，溫州市化學(xué)試劑有限公司，先用滅菌水配制0．1%母液，使用時(shí)稀釋500倍。

1．2 動(dòng)物飼養(yǎng)和魚卵采集

斑馬魚親魚為AB系，由北京大學(xué)生命科學(xué)研究院惠贈(zèng)。斑馬魚的養(yǎng)殖和繁殖參照Westerfield的方法［15］。光照周期 L∶D=14 h∶10 h，水溫(28±1)℃，養(yǎng)魚系統(tǒng)循環(huán)水為去離子水加海鹽，保持電導(dǎo)率450～500 μs·cm-1，用 NaHCO3調(diào)節(jié) pH 值為7．0左右。使用新鮮孵化的豐年蝦喂養(yǎng)，一日2次。5月齡后雌雄魚分箱飼養(yǎng)。

實(shí)驗(yàn)前1天晚間將7～18月齡成魚放入交配缸(雌∶雄=1∶1)。次日清晨取隔板后，采集30 min內(nèi)產(chǎn)受精卵，用循環(huán)水清洗2遍后放入孵化液中，同時(shí)加入亞甲基藍(lán)溶液防止真菌產(chǎn)生，于28．5℃繼續(xù)孵化。受精后2 h(2 hpf)體式顯微鏡下觀察，確定發(fā)育階段［16］并選擇正常受精卵備用。

1．3 實(shí)驗(yàn)儀器

Noldus幼魚運(yùn)動(dòng)行為儀(Noldus Information Technology，美國(guó));體式顯微鏡及成像系統(tǒng)(OLYMPUS SZX16，日本);電子天平(Sartorius BT224S和LP1200S，德國(guó))。

1．4 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備和受試液處理

將收集36 hpf斑馬魚胚胎置于6孔板中，約60枚/孔。吸凈孵化水后迅速加入5 mL氯化鎘受試溶液，每孔一個(gè)劑量濃度。給藥后放入28．5℃孵箱中繼續(xù)孵化。及時(shí)取出死亡魚卵或幼魚。至6 dpf前每日更換2次受試液，每次更換2．5mL。實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)正常對(duì)照組，每日更換新鮮孵化水。6 dpf時(shí)在體式顯微鏡下觀察記錄幼魚的形態(tài)變化，記錄死亡和畸形情況以及畸形特征。選擇96 hpf死亡率和畸形率＜5%的劑量組幼魚作為實(shí)驗(yàn)用魚。將外觀正常的幼魚逐條放入潔凈48孔板中，24條/劑量組。每孔保持1 mL受試液。乙醇處理方法:將5 mL不同濃度乙醇溶液分別放入潔凈6孔板中，1劑量組/孔。用小濾勺將正常對(duì)照6 dpf幼魚迅速移至6孔板中，60條/劑量組。然后逐條轉(zhuǎn)移幼魚至48孔板中，24條/劑量組。每孔1 mL受試液。同時(shí)設(shè)立正常對(duì)照。

1．5 幼魚自發(fā)運(yùn)動(dòng)觀察

將48孔板放入Noldus幼魚運(yùn)動(dòng)行為儀內(nèi)適應(yīng)5 min。采集3 min幼魚自發(fā)運(yùn)動(dòng)視頻。應(yīng)用Ethovision XT軟件(Noldus Information Technology)將運(yùn)動(dòng)軌跡可視化，導(dǎo)出3 min內(nèi)幼魚移動(dòng)距離、運(yùn)動(dòng)速度等運(yùn)動(dòng)參數(shù)。乙醇暴露組的實(shí)驗(yàn)時(shí)間為:4%組為暴露后30 min;1%、2%組為暴露后45 min;0．5%組為暴露后1 h。實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)正常對(duì)照。實(shí)驗(yàn)時(shí)段為12:30—15:30，接近幼魚運(yùn)動(dòng)平臺(tái)期［14］。

1．6 幼魚對(duì)強(qiáng)光刺激的驚恐逃避反射實(shí)驗(yàn)

將48孔板放入Noldus幼魚運(yùn)動(dòng)行為儀內(nèi)適應(yīng)5 min后，控制Noldus幼魚運(yùn)動(dòng)行為儀采集11 min幼魚運(yùn)動(dòng)視頻，其中前5 min為黑暗期，第6 min通過Ethovision XT軟件編程控制行為儀開啟底燈強(qiáng)光照射1 min后迅速關(guān)閉。應(yīng)用Ethovision XT軟件導(dǎo)出每分鐘幼魚運(yùn)動(dòng)速度、移動(dòng)距離等參數(shù)。實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)正常對(duì)照。實(shí)驗(yàn)時(shí)段為12:30—15:30。

1．7 結(jié)果統(tǒng)計(jì)和分析

將運(yùn)動(dòng)參數(shù)按劑量組整理匯總，用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差(Mean±SD)表示。應(yīng)用軟件SPSS11．5進(jìn)行單因素One-Way方差分析，即在方差齊性檢驗(yàn)的基礎(chǔ)上分別采用LSD(方差齊時(shí))或Tamhane(方差不齊時(shí))檢驗(yàn)，比較正常對(duì)照組和各劑量組間運(yùn)動(dòng)參數(shù)差異，當(dāng)P＜0．05時(shí)，認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果(Results)

在36 hpf～6 dpf期限內(nèi)鎘暴露組幼魚死亡率畸形率均低于5%。體式顯微鏡下觀察可見，暴露劑量≤1．0 μmol·L-1時(shí)，除個(gè)別幼魚體色變淺外，外觀形態(tài)未見明顯異常，可用于行為學(xué)實(shí)驗(yàn)。

2．1 低劑量氯化鎘暴露對(duì)斑馬魚幼魚自發(fā)運(yùn)動(dòng)的影響

將6 dpf幼魚的自發(fā)運(yùn)動(dòng)軌跡可視化，結(jié)果顯示:與正常對(duì)照相比，0．1 ～0．5 μmol·L-1暴露組幼魚運(yùn)動(dòng)自發(fā)運(yùn)動(dòng)軌跡增多、紊亂，并伴有刻板式轉(zhuǎn)向活動(dòng)增多，觸壁反射活動(dòng)減少;而0．5 ～1．0 μmol·L-1暴露組幼魚出現(xiàn)僵直、震顫和小范圍內(nèi)轉(zhuǎn)圈現(xiàn)象，以1．0μmol·L-1組更為明顯(見圖1)。以上結(jié)果表明，胚胎期和幼魚早期階段持續(xù)性氯化鎘暴露能夠改變幼魚的運(yùn)動(dòng)方式。

圖1 36 hpf～6 dp f氯化鎘暴露后6 dpf幼魚運(yùn)動(dòng)軌跡

自發(fā)運(yùn)動(dòng)參數(shù)分析發(fā)現(xiàn)，在0．1 ～1．0 μmol·L-1范圍內(nèi)隨暴露劑量增大，幼魚自發(fā)運(yùn)動(dòng)距離由增高轉(zhuǎn)向降低，呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性倒“U”型反應(yīng)趨勢(shì)(圖2A)，而由于 0．25 ～1．0 μmol·L-1暴露組幼魚增快和減慢2種運(yùn)動(dòng)并存，因而平均速度值沒有顯著性差異(圖2B)，通過最大移動(dòng)速度、快速運(yùn)動(dòng)(速度≥2．0 cm·s-1)持續(xù)時(shí)間及出現(xiàn)頻率比較(圖2C、2D、2E)，發(fā)現(xiàn)雖然組內(nèi)參數(shù)差異較大，但各劑量組依然從一定程度上能夠反映組間倒“U”型毒性效應(yīng)，這與實(shí)驗(yàn)中乙醇暴露后幼魚產(chǎn)生的倒“U”型運(yùn)動(dòng)效應(yīng)相類似，即0．5% ～2%乙醇較長(zhǎng)時(shí)程暴露具有運(yùn)動(dòng)興奮效應(yīng)，而4%乙醇較短時(shí)程暴露則具有明顯的抑制作用(見圖3)。結(jié)果表明，早期氯化鎘暴露能夠損害幼魚的自發(fā)運(yùn)動(dòng)能力。

圖2 36 hpf～6 dpf氯化鎘暴露對(duì)6 dpf幼魚自發(fā)運(yùn)動(dòng)的影響

圖3 乙醇急性暴露對(duì)6 dpf幼魚自發(fā)運(yùn)動(dòng)的影響

2．2 鎘暴露后幼魚驚恐反射及適應(yīng)能力改變

本研究選擇的實(shí)驗(yàn)時(shí)間為斑馬魚白天活動(dòng)平臺(tái)期，在轉(zhuǎn)移至黑暗環(huán)境中適應(yīng)一段時(shí)間后，斑馬魚幼魚表現(xiàn)為靜息或平穩(wěn)游動(dòng)。突然給予強(qiáng)光照射，正常幼魚對(duì)外界刺激的反應(yīng)表現(xiàn)為驚跳后迅速靜止不動(dòng)或速度明顯降低。而突然撤除光源后，幼魚表現(xiàn)為速度激增后又逐漸減慢的過程。以光、暗交替時(shí)刻前后1 min內(nèi)速度變化以及光、暗期內(nèi)每分鐘移動(dòng)距離作為行為學(xué)指標(biāo)評(píng)價(jià)幼魚對(duì)外界刺激的反應(yīng)和適應(yīng)能力。如圖4所示。其中，0．1～0．5 μmol·L-1組幼魚暗-光交替時(shí)加速度增大運(yùn)動(dòng)狀態(tài)以興奮為主;而光-暗交替時(shí)，暴露組幼魚運(yùn)動(dòng)加速度呈劑量依賴性降低。此外，正常對(duì)照組幼魚在轉(zhuǎn)入黑暗環(huán)境后5 min即可恢復(fù)到光照前運(yùn)動(dòng)水平。與正常對(duì)照組光照前的平均水平相比，0．1 和0．25 μmol·L-1暴露組在撤除光源后5 min運(yùn)動(dòng)仍很活躍;0．5 μmol·L-1暴露組暗恢復(fù)時(shí)程則縮短為4 min;1．0 μmol·L-1暴露組除在第3分鐘時(shí)運(yùn)動(dòng)水平有所下降外，其余時(shí)間均未表現(xiàn)出顯著變化。與同時(shí)間內(nèi)正常對(duì)照組運(yùn)動(dòng)水平相比，在撤除光源4 min內(nèi)暴露組幼魚恢復(fù)能力呈劑量依賴性倒“U”型改變。

圖4 36 hpf～6 dpf氯化鎘暴露對(duì)6 dpf幼魚驚恐反射實(shí)驗(yàn)中反應(yīng)能力和適應(yīng)能力的影響

以上結(jié)果表明，0．1 ～0．5 μmol·L-1組幼魚對(duì)外界刺激反應(yīng)比較敏感，0．1 和 0．25 μmol·L-1組刺激后恢復(fù)能力減弱。而1．0μmol·L-1組反應(yīng)比較遲鈍，運(yùn)動(dòng)能力一直在低水平徘徊。

3 討論(Discussion)

鎘作為一種重要的環(huán)境重金屬污染物污染，可以在生物體內(nèi)富集，并通過食物鏈進(jìn)入人體，引起慢性鎘中毒。因此鎘對(duì)人體健康，特別是對(duì)未成年人發(fā)育的毒性影響日益引起關(guān)注。模式動(dòng)物斑馬魚除具有容易飼養(yǎng)、實(shí)驗(yàn)操作方便等特點(diǎn)外，胚胎和早期幼魚在神經(jīng)發(fā)育毒性研究中又有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)［10，17］。首先，斑馬魚發(fā)育早期通體透明，容易應(yīng)用染色劑、熒光抗體、基因探針等技術(shù)整體觀察神經(jīng)組織或器官的器質(zhì)性病變。第二，幼魚運(yùn)動(dòng)行為按照固定的順序發(fā)育，發(fā)育過程中能夠產(chǎn)生運(yùn)動(dòng)、探索、學(xué)習(xí)等一系列復(fù)雜行為的變化。而行為活動(dòng)作為最敏感的指標(biāo)［18］，是機(jī)體通過自身機(jī)能的調(diào)整消除或減少損傷的表觀反映。行為學(xué)的檢測(cè)雖然相對(duì)比較簡(jiǎn)單，但能夠從宏觀上早期發(fā)現(xiàn)外源化合物引起的神經(jīng)功能性障礙，較引起器質(zhì)性改變后的病理學(xué)檢查更為直接、敏感并且經(jīng)濟(jì)、有效。本次實(shí)驗(yàn)中造成神經(jīng)行為學(xué)改變的最高暴露劑量為1．0μmol·L-1，比斑馬魚的半數(shù)致死濃度(168 μmol·L-1)［19］、嗅覺依賴性對(duì)捕食者回避行為損傷的劑量(125μmol·L-1)［20］或引起胚胎腦部發(fā)育不良的暴露劑量(100 μmol·L-1)［11］要小100多倍。而最早染毒時(shí)期為36 hpf，此時(shí)胚胎體軸、肌節(jié)和心臟、腦等已基本形成［16］。因此，實(shí)驗(yàn)中暴露組幼魚的神經(jīng)行為表現(xiàn)能夠充分反映整體神經(jīng)功能變化，較于病理損傷或死亡更為直觀、敏感。

本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了早期持續(xù)性鎘暴露所致斑馬魚幼魚自發(fā)運(yùn)動(dòng)能力變化，結(jié)果表明，鎘暴露組幼魚的行為強(qiáng)度變化與環(huán)境污染物之間存在倒“U”型劑量-效應(yīng)關(guān)系。這與乙醇急性暴露時(shí)斑馬魚幼魚產(chǎn)生的行為方式相類似。有研究認(rèn)為，乙醇暴露能夠損傷斑馬魚的視神經(jīng)［17，21］，降低視覺敏感性，損傷中樞神經(jīng)元、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和抑制骨骼的發(fā)育［22-23］，亦或影響腦內(nèi)多巴胺受體的敏感性［24］，從而改變斑馬魚的運(yùn)動(dòng)能力。而鎘在生物體內(nèi)具有明顯的蓄積作用，本實(shí)驗(yàn)中暴露組幼魚的興奮行為是否源于鎘暴露導(dǎo)致的神經(jīng)痛;運(yùn)動(dòng)抑制行為產(chǎn)生的原因是否是為鎘中毒所致的中樞神經(jīng)和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)功能障礙或相關(guān)組織如眼、骨骼肌發(fā)育不良等，尚需進(jìn)一步研究。

光照驚恐反射是一種由視覺誘導(dǎo)的明顯生理反應(yīng)。正常斑馬魚在經(jīng)過一段時(shí)間的適應(yīng)后，如其所在區(qū)域的光線突然變暗或者變亮，它會(huì)有一個(gè)迅速逃脫該區(qū)域的動(dòng)作。斑馬魚的驚恐反應(yīng)于68 hpf產(chǎn)生，斑馬魚的眼睛正在形成且視網(wǎng)膜神經(jīng)元突觸也正在建立，而發(fā)育至96 hpf后，幼年斑馬魚具有自由運(yùn)動(dòng)的能力［25］。因此，光照刺激引發(fā)的驚恐反應(yīng)能力和刺激撤除后行為恢復(fù)能力的變化，可用于檢測(cè)由視覺引發(fā)的感覺運(yùn)動(dòng)高級(jí)神經(jīng)回路是否正常。本實(shí)驗(yàn)中鎘暴露后斑馬魚幼魚在驚恐反射中表現(xiàn)出對(duì)突發(fā)外界刺激的反應(yīng)能力以及撤除刺激后的適應(yīng)能力呈現(xiàn)劑量依賴性增強(qiáng)或減弱的變化。一方面印證了自發(fā)運(yùn)動(dòng)中行為毒性效應(yīng)在光刺激出現(xiàn)時(shí)引起運(yùn)動(dòng)興奮或抑制效應(yīng)，并因此導(dǎo)致相應(yīng)的暗適應(yīng)時(shí)程的延緩或加速。另一方面，驚恐反應(yīng)敏感提示暴露劑量下幼魚的視覺功能未受到影響，但運(yùn)動(dòng)功能受到損傷;而1．0μmol·L-1組幼魚反應(yīng)遲鈍則表明，在該劑量下幼魚除運(yùn)動(dòng)功能受損外還可能存在視覺功能障礙。另外，本實(shí)驗(yàn)中正常幼魚在驚恐反射光照期內(nèi)表現(xiàn)出短暫逃避行為后的運(yùn)動(dòng)抑制現(xiàn)象與筆者之前于夜間所做的驚恐反射實(shí)驗(yàn)中運(yùn)動(dòng)激增的表現(xiàn)不一致［26］，表明斑馬魚在白天和夜晚對(duì)視覺引導(dǎo)的驚恐反應(yīng)方式存在差異。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用幼魚運(yùn)動(dòng)行為儀和相關(guān)軟件的基礎(chǔ)上采用的視頻采集、圖像跟蹤技術(shù)進(jìn)行高通量的檢測(cè)，能夠同時(shí)觀察對(duì)多個(gè)劑量組、多實(shí)驗(yàn)對(duì)象運(yùn)動(dòng)軌跡的實(shí)時(shí)變化、并對(duì)多個(gè)運(yùn)動(dòng)參數(shù)進(jìn)行定量分析，減少了哺乳動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中存在的實(shí)驗(yàn)時(shí)間耗時(shí)長(zhǎng)、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物存在應(yīng)激等弊端，提高檢測(cè)效率和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的客觀、真實(shí)性。并且，實(shí)驗(yàn)中對(duì)乙醇急性暴露后斑馬魚幼魚的倒“U”型行為毒性效應(yīng)不僅驗(yàn)證了前人的［14，24］研究結(jié)果，還證明了斑馬魚幼魚運(yùn)動(dòng)行為學(xué)的高通量檢測(cè)技術(shù)具有良好的可重復(fù)性。此項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用能夠拓展模式動(dòng)物斑馬魚作為替代模型在毒理學(xué)研究中的應(yīng)用空間，同時(shí)為建立環(huán)境污染監(jiān)測(cè)預(yù)警技術(shù)提供理論依據(jù)。

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