利用SOS/umu測試方法鑒定沙潁河河水中的遺傳毒性物質(zhì)

張建超，馬?？。ㄓ?，*

1．山東師范大學生命科學學院，濟南250014

2．北京大學城市與環(huán)境學院，北京100871

水體的安全問題一直受到人們的廣泛關(guān)注。研究表明，地表水中存在著遺傳毒性物質(zhì)［1-2］，低劑量長期暴露于這些物質(zhì)會增加人類的患癌風險［3］，因此，解析水環(huán)境中遺傳毒性成因是進行有效環(huán)境管理的基礎(chǔ)。

由于水環(huán)境中的遺傳毒性物質(zhì)種類非常繁多，而且其濃度又非常小，因此，僅用化學檢測方法較難綜合評價水體中的遺傳效應。生物檢測方法能夠檢測多種物質(zhì)共存下的綜合毒性效應，在環(huán)境領(lǐng)域具有一定范圍的應用。特別是以毒性檢測為導向的遺傳毒性物質(zhì)的鑒定評價方法(toxicity identification evaluation，TIE)能夠更加有效地鑒定環(huán)境樣品中遺傳毒性物質(zhì)［2，4-5］。但是除了環(huán)境樣品本身基質(zhì)高給痕量物質(zhì)的鑒定帶來難度之外，遺傳毒性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)特性各異，作用機制也各不相同，僅僅采用目前常用的遺傳毒性生物檢測方法如Ames實驗、微核實驗以及SOS/umu實驗進行物質(zhì)鑒定依然存在較大難度。

芳香胺和硝基芳烴是兩大類重要的遺傳毒性物質(zhì)，對細菌和哺乳動物細胞都具有致突變性［6-10］，芳香胺易誘導人體產(chǎn)生膀胱癌［11-12］、胃癌、食道癌、肝癌和胰腺癌等癌癥［13］，硝基芳烴化合物是一種潛在的致癌物質(zhì)，可引起肺、肝臟和腎臟的損傷［14-16］。這些物質(zhì)均需要O-乙酰轉(zhuǎn)移酶(O-AT)的代謝才能產(chǎn)生遺傳毒性效應。Ames實驗中，O-AT過量表達的菌株YG1024、YG1029已經(jīng)應用于環(huán)境樣品的檢測;SOS/umu實驗中，O-AT過量表達的菌株NM2009也已經(jīng)被開發(fā)出來并逐漸應用于環(huán)境樣品的遺傳毒性檢測中。這些菌株能夠特異性地和高靈敏度地檢測芳香胺和硝基芳烴這2類物質(zhì)［17-20］。與Ames實驗相比，SOS/umu實驗具有所需菌株種類少、操作簡單快速等優(yōu)點，NM2009在檢測水樣中的芳香胺類物質(zhì)及硝基芳烴化合物方面更具優(yōu)勢。

為了研究河南沈丘癌癥高發(fā)地區(qū)的沙潁河河水中的潛在遺傳毒性物質(zhì)，本研究用HLB固相萃取柱富集水樣中的微量化學物質(zhì)，HPLC分割樣品后，用生物檢測方法測試各餾分的遺傳毒性效應。選用了SOS/umu測試體系，比較了原菌TA1535/pSK1002和O-AT過表達的SOS/umu菌株NM2009的檢測結(jié)果，探索沙潁河河水中是否存在芳香胺類或硝基芳烴類物質(zhì)。

1 材料與方法(M aterials and methods)

1．1 實驗試劑及儀器

色譜純甲醇、丙酮、正己烷、二氯甲烷和乙腈購自 Fisher Chemical(Fair Lawn，NJ，USA)，4-硝基喹啉-1-氧化物(4-nitroquinoline-1-oxide，4-NQO，純度98%，Acros Organics)和 2-氨基蒽(2-aminoanthracene，2-AA，純度 96%，Acros Organics)用作陽性對照;二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO，ACS級，美國AMRESCO)為稀釋溶劑和陰性對照;十二烷基磺酸鈉(SDS);鄰硝基酚-β-D-半乳糖苷(O-nitrophenol-b-D-galactopyranoside，ONPG，東京化成);酵母膏提取物(yeast extract，OXIOD);胰蛋白胨(tryptone，OXIOD);BIO-RAD 550酶標儀;Costar 96孔酶標板;Minishaker震蕩器。

大鼠肝微粒體酶溶液(S9溶液)自提:大鼠經(jīng)苯巴比妥鈉和β-萘黃酮誘導后處死，取肝臟加KCl溶液后勻漿、離心。上清即為S9溶液，S9輔助因子:NADH、NADPH 和 G-6-P(購自美國 Sigma)，MgCl2、KCl、Na2HPO4和NaH2PO4(購自國藥集團化學試劑公司)。

1．2 樣品采集與前處理

2011年12月，從河南省沈丘縣趙口村的沙潁河中采集10 L水樣(圖1)。水樣經(jīng)1．2μm Whatman GF/C玻璃纖維紙(Maidstone，UK)過濾后，過HLB固相萃取柱(6mL，500mg，Waters Oasis，USA)，每根HLB柱富集2 L水，流速為5～10mL·min-1。HLB柱用之前需經(jīng)6mL正己烷、6 mL丙酮、6 mL甲醇和6 mL超純水活化。HLB柱富集后，用氮氣吹干。然后每根HLB柱用20mL丙酮洗脫，其中5 mL在微弱的氮氣流下吹干后用DMSO定容到6．25μL;剩余的15mL吹干后用甲醇溶解，用于HPLC分割。實驗空白使用相同方法富集2 L超純水。沒有檢測到遺傳毒性。

圖1 沙潁河流域采樣點Fig．1 Sampling site from Shaying River

1．3 HPLC 分割

高效液相色譜分割的色譜條件:采用RP C18柱(4．6 mm ×250 mm Waters，USA)梯度洗脫，柱溫為室溫，流速1 mL·min-1，流動相A為乙腈，B為超純水。梯度設(shè)置如表1所示，在0～36 min內(nèi)，每隔2 min收集1個樣品，共分割獲得18個餾分。分割后的樣品用真空冷凍干燥除去溶劑，為了減少冷凍干燥過程中的損失，樣品瓶用帶有小孔的鋁箔封口，盡量減少冷凍干燥的接觸面積，并嚴格控制干燥時間，等干燥完成后立即取出樣品。最后，每一餾分用95μL DMSO定容，以待生物測試。

表1 HPLC分割梯度條件Table 1 Gradient conditions of HPLC fractionation

1．4 SOS/umu 實驗

選用了SOS/umu實驗的2種菌株:鼠傷寒沙門氏菌的原始菌株TA1535/pSK1002和O-AT過量表達的NM2009菌株。NM2009菌株對芳香胺類物質(zhì)和硝基芳烴類物質(zhì)有較強的響應能力。

SOS/umu測試按文獻［21］所提供的方法，具體操作如下:將凍存的菌液置于含氨芐青霉素和氯霉素的LB培養(yǎng)基(1 g NaCl、1 g酵母膏提取物、2 g胰蛋白胨溶于200 mL超純水，高壓滅菌，放置冷卻;在TA1535/pSK1002的實驗中加最終濃度50 mg·L-1的氨芐青霉素，NM2009的實驗中加最終濃度25mg·L-1的氨芐青霉素和最終濃度10 mg·L-1的氯霉素)中。30℃下振蕩培養(yǎng)過夜，次日上午將前夜培養(yǎng)的菌液用新鮮的TGA培養(yǎng)基(1 g NaCl、1 g D-葡萄糖、2 g胰蛋白胨溶于200mL超純水，高壓，放置冷卻，加氨芐青霉素至最終濃度為20mg·L-1)稀釋100倍，用酶標儀測定595 nm處的吸光度(A595)為0．05 ～0．09 左右，37℃下振蕩培養(yǎng)1．5 h 進行前培養(yǎng)。然后，將300μL前培養(yǎng)菌液與10μL濃縮后的水樣混合，按需要添加S9溶液，37℃下振蕩培養(yǎng)2 h進行濃縮水樣暴露。取150μL培養(yǎng)后的菌液測定A595，另取100 μL 菌液與900 μL Z-緩沖液(0．1mol·L-1磷酸緩沖液(pH 7．4)、10mmol·L-1KCl、1mmol·L-1Mg-SO4、1mg·mL-1巰基乙醇)，50 μL 1 mg·mL-1SDS 和 50 μL氯仿混合搖勻，再加入200μL的ONPG緩沖溶液(6 mg·mL-1ONPG，0．1 mol·L-1Na2HPO4和 0．1 mol·L-1KH2PO4)，30℃下靜置20 min進行酶促反應。最后加500 μL的1mol·L-1Na2CO3溶液終止反應，吸取150 μL的上清液于96孔酶標板中，用酶標儀測定415 nm(A415)和570 nm(A570)波長下的吸光度。

最后，β-半乳糖甘酶誘導活性可由下式獲得:

β-半乳糖苷酶誘導活性(unit)=1000×(A415-1．75× A570)/(t × V × A595)

式中，t表示酶促反應的時間(min)，V表示反應菌液在顯色過程中的稀釋倍率，A595、A415、A570為吸光度值。A595表示實驗開始時的細菌密度，A415表示酶與底物反應生成物鄰硝基苯酚的含量，A570表示反應結(jié)束產(chǎn)生的顆粒性干擾物。DMSO做溶劑對照，4-NQO和2-AA分別做TA1535/pSK1002和NM2009的陽性對照。β-半乳糖甘酶誘導活性為對照組2倍時則視為陽性。未分割樣品采用2倍稀釋測試8個梯度3個平行，分割樣品采用3倍稀釋測試6個梯度3個平行，溶劑空白測試3個平行。

為了評價所富集水樣的遺傳毒性強度，將樣品折算為4-NQO等當量濃度和2-AA等當量濃度來進行評估。根據(jù)4-NQO、2-AA和樣品的劑量效應曲線，采用以下公式:

其中，k樣、k4-NQO、k2-AA分別表示濃縮水樣、4-NQO 和2-AA劑量效應曲線中的線性部分的斜率。圖2展示了陽性對照物質(zhì)的低濃度線性部分的劑量效應曲線。

圖2 陽性對照物質(zhì)4NQO和2-AA的劑量效應曲線Fig．2 Dose-response curves of positive controls4-NQO and 2-AA

2 結(jié)果與討論(Results and discussion)

圖3所示為采用TA1535/pSK1002菌株(無S9溶液代謝)測定HLB柱富集后的河水樣品的劑量效應曲線?？梢钥吹剑敱┞读繛?．00625～0．2 L時，β-半乳糖苷酶的活性隨暴露水樣體積的增加而增加，表現(xiàn)出明顯的劑量效應關(guān)系，表明水樣具有遺傳效應。但是當暴露量增加到0．4 L之后，隨暴露水樣的增加，β-半乳糖甘酶誘導活性上升緩慢。實驗中觀測到，當水樣在0．00625～0．2 L范圍時，A595值大約為0．277，隨后，A595值則隨水樣的增加而降低，水樣為0．8 L 時，A595已降低到 0．205，顯示出細胞毒性?？紤]到可能是河水中復雜的污染物質(zhì)影響了菌株活性，因此以后的實驗中，對樣品進行HPLC分割，測試各餾分的遺傳效應。

圖3 用TA1535/pSK 1002菌株測定的水樣遺傳毒性的劑量效應曲線

圖4所示為河水樣品進行HPLC分割后所獲得的每個餾分的活性測試結(jié)果。從圖4可以看出，采用TA1535/pSK1002原始菌株和NM2009菌株進行SOS/umu實驗都檢測出河水樣品分割后的餾分具有遺傳毒性效應。TA1535/pSK1002–S9測試時，保留時間為18～20 min的餾分10(F10)表現(xiàn)出遺傳毒性，而TA1535/pSK1002+S9測試時，除了F10外，餾分15(F15，保留時間為28～30 min)也表現(xiàn)出遺傳毒性，說明河水中存在某些需經(jīng)過S9溶液代謝活化才能顯示出遺傳毒性的物質(zhì)。

圖4 利用菌株TA1535/pSK1002和NM 2009測定河水的遺傳毒性

芳香胺和硝基芳烴都可以被S9溶液代謝活化［22-23］。研究表明，在Cyp1A2酶的作用下，芳香胺代謝氧化形成N-羥基胺中間體［24］，然后在乙酰轉(zhuǎn)移酶(AT)的作用下，產(chǎn)生“陽氮離子”(R2-N+)攻擊DNA引起DNA損傷而癌變。硝基芳烴化合物的作用機理類似，在硝基還原酶和O-AT的作用下形成“陽氮離子”產(chǎn)生遺傳毒性［22］。為探討沙潁河河水中是否含有芳香胺和硝基芳烴類物質(zhì)，采用對其有特殊響應的NM2009菌株對分割后的水樣進行SOS/umu測試。結(jié)果表明，F(xiàn)8(保留時間為14～16 min)、F9(保留時間為 16 ～18 min)、F10(保留時間為18～20 min)餾分的遺傳毒性測試結(jié)果都呈現(xiàn)陽性，但是在TA1535/pSK1002+S9測試中呈陽性結(jié)果的F15并沒有表現(xiàn)出遺傳毒性，這可能是因為NM2009菌株過量表達O-AT，可以對芳香胺類物質(zhì)和硝基芳烴化合物表現(xiàn)出較強的響應，但是對其他一些遺傳毒性物質(zhì)的靈敏度低于原始菌株。例如使用菌株TA1535/pSK1002時，B［α］P的最低響應濃度為1．25 μmol·L-1，而使用 NM2009 菌株時，B［α］P 在40 μmol·L-1時都沒有顯現(xiàn)出遺傳毒性［25］。為進一步鑒定河水中的遺傳毒性物質(zhì)，本研究進一步比較了F8、F9、F10和F15這4個餾分采用3種方法測試的劑量效應曲線。

圖5所示為 F8、F9、F10和 F15采用 TA1535/pSK1002菌株和NM2009菌株測得的劑量效應曲線，縱坐標表示水樣β-半乳糖甘酶活性與其溶劑對照的比值。從圖中可知，即使水量達到0．4 L，A595值未出現(xiàn)降低，β-半乳糖甘酶活性也呈現(xiàn)出明顯上升趨勢，這主要是因為通過HPLC樣品分割去除了一些共存物質(zhì)，降低了高濃度暴露的細胞毒性。從圖5可知，采用TA1535/pSK1002菌株檢測F8和F9時，無論是否加S9代謝，β-半乳糖甘酶活性都隨著暴露水量的增加而增加，即使水量增加到0．8 L，其誘導活性也不到陰性對照的2倍，這2個餾分的遺傳毒性顯示陰性;但是用NM2009檢測F8和F9餾分，暴露水量從0．0033 L增加到0．8 L時，F(xiàn)8的β-半乳糖苷酶活性從陰性對照的1．1倍增加到2．7倍，F(xiàn)9從1．16倍增加到2．33倍，表現(xiàn)出了非常顯著的劑量效應關(guān)系，遺傳毒性顯示陽性，表明這2個餾分中含有芳香胺類或硝基芳烴類遺傳毒性物質(zhì)。當采用TA1535/pSK1002原始菌株檢測F10，不管是否添加S9，都顯示出遺傳效應，但是NM2009菌株測試時活性遠高于原始菌，說明芳香胺類或硝基芳烴類物質(zhì)是F10的主要遺傳毒性物質(zhì)。至于 F15餾分，TA1535/pSK1002+S9測試時，β-半乳糖甘酶活性呈現(xiàn)很好的劑量效應關(guān)系，暴露水量為0．8 L時，β-半乳糖甘酶活性是陰性對照的2倍，呈現(xiàn)陽性，但是用NM2009實驗時，β-半乳糖甘酶活性僅達到陰性對照的1．4倍，由此判斷F15中的遺傳毒性物質(zhì)不是芳香胺和硝基芳烴類物質(zhì)，需要進一步鑒定。

圖5 TA1535/pSK1002和NM 2009菌株測定的HPLC分割活性餾分遺傳毒性的劑量效應曲線

綜上所述，筆者認為，河南沈丘癌癥高發(fā)區(qū)的沙潁河水中含有芳香胺或硝基芳烴類遺傳毒性物質(zhì)，這一信息為該地區(qū)水域中的遺傳毒性鑒定提供了方法，為當?shù)匕┌Y高發(fā)成因解析提供了基礎(chǔ)信息。

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