血液科造血干細(xì)胞移植技術(shù)新進(jìn)展與發(fā)展設(shè)想

陳惠仁

造血干細(xì)胞移植(HSCT)是治療血液系統(tǒng)惡性疾病的有效方式之一。最近二十年，HSCT技術(shù)飛速發(fā)展，愈趨成熟，更為安全有效，已成為治愈白血病、淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤等血液系統(tǒng)惡性疾病，及良性血液病的重要方法。隨著對HSCT研究的不斷深入，人們對其治療血液病的機(jī)制有了更為理性的認(rèn)識，臨床療效不斷提高，逐步擴(kuò)展了移植的應(yīng)用領(lǐng)域。

1 國內(nèi)外本專業(yè)學(xué)科發(fā)展簡史和現(xiàn)狀

1.1 本專業(yè)學(xué)科領(lǐng)域發(fā)展簡史 開展骨髓移植治療血液病的歷史有100年左右，經(jīng)歷了實(shí)驗(yàn)室的發(fā)展到臨床的治療。早在1937—1939年，Schretenmeyer及Osgood等首先將骨髓細(xì)胞成分用于再生障礙性貧血的臨床治療。隨后在1945年前后，由于核武器的應(yīng)用，使實(shí)驗(yàn)性骨髓移植研究工作進(jìn)展很快，在動物研究(包括小鼠、狗、猴子等)方面取得新進(jìn)展。1951年，Lorenz等首先成功地進(jìn)行了骨髓移植實(shí)驗(yàn)，使受致死劑量照射的小白鼠的存活率明顯提高。1958年，Mathe等首先對5例受放射意外的傷者成功地進(jìn)行了骨髓移植。1963年，Mathe首先報道了對1例難治性急性淋巴細(xì)胞白血病進(jìn)行同種異基因骨髓移植，患者存活了20個月。此后十余年，骨髓移植的實(shí)驗(yàn)研究和臨床應(yīng)用有所增加。但是，由于進(jìn)行骨髓移植的患者多屬晚期急性白血病，加之當(dāng)時對組織配型缺乏系統(tǒng)認(rèn)識，移植效果均不理想。70年代以后，由于移植免疫學(xué)、組織配型技術(shù)等基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)的發(fā)展，骨髓移植的實(shí)驗(yàn)研究和臨床應(yīng)用又日漸活躍。1979年，Thomas等［1］報道了用組織相容性白細(xì)胞抗原(HLA)相合異基因骨髓移植治療100例晚期急性白血病，其中13例存活1年以上，大大鼓舞了人們對其進(jìn)行深入研究，并在全世界范圍內(nèi)廣泛開展。骨髓移植的臨床療效有了明顯的提高，部分病例可以長期存活。

1.2 本專業(yè)學(xué)科領(lǐng)域國內(nèi)先進(jìn)學(xué)科技術(shù)發(fā)展現(xiàn)狀我國于50年代末開始動物骨髓移植實(shí)驗(yàn)研究，1963年嘗試過對患者進(jìn)行骨髓移植治療，1964年，陸道培院士取得了同卵雙生骨髓移植治療再生障礙性貧血的成功，80年代報道骨髓移植治療白血病成功。國內(nèi)骨髓移植技術(shù)發(fā)展迅速，治療例數(shù)增加，技術(shù)的發(fā)展完善了治療的方法。隨著中華骨髓庫志愿者人數(shù)的增加，非血緣關(guān)系骨髓移植技術(shù)有較廣闊的發(fā)展前景。中國造血干細(xì)胞捐獻(xiàn)者資料庫已經(jīng)有29個省級分庫，到目前為止已登記在冊并完成配型的人數(shù)達(dá)到了120多萬，每年為數(shù)百例患者提供了造血干細(xì)胞。在非血緣志愿者骨髓庫中能否找到HLA相合的非血緣志愿者與以下幾點(diǎn)有關(guān):①志愿供髓庫的大小。志愿者骨髓庫越大，HAL相合的可能性越大。②受者HLA單倍體表型。例如一個約10萬人的志愿者庫，人群常見HLA單倍體表型受者找到合適供者的可能性為90%，而人群少見表型者找到合適供者的可能性不到10%。③患者的原發(fā)疾病情況。慢性髓系白血病慢性期，患者一般情況好，有充分的時間找尋非血緣供者，因而找到的概率高于急性白血病及急性再生障礙性貧血的患者。HLA不合供者移植技術(shù)的發(fā)展，解決了骨髓源問題，HLA不合移植具有以下特點(diǎn):①供者來源更加廣泛。②成本低。建立及維持非血緣關(guān)系供者庫需要大量投資，而親屬部分相合的供者則不需要特殊費(fèi)用。③從倫理及技術(shù)方面講，其有更強(qiáng)的可操作性，由于親情關(guān)系的存在，供者的捐獻(xiàn)意愿更強(qiáng)，且當(dāng)再次需要供者來源的干細(xì)胞或淋巴細(xì)胞以解決植入不良及復(fù)發(fā)等并發(fā)癥時，可操作性更強(qiáng)，有利于總體生存率的提高。HLA配型不合移植技術(shù)成熟，已經(jīng)有長期隨訪結(jié)果。

國內(nèi)在20世紀(jì)90年代初，發(fā)現(xiàn)粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)對動員的外周血干細(xì)胞(PBSC)免疫特性存在調(diào)節(jié)作用［2］。經(jīng)G-CSF動員的PBSC中B淋巴細(xì)胞及單核細(xì)胞B7的總表達(dá)水平下調(diào)，樹突狀細(xì)胞(DC)數(shù)量增加，DC1/DC2比例倒置，而經(jīng)GCSF動員的骨髓造血干細(xì)胞中T淋巴細(xì)胞CD28、B淋巴細(xì)胞及單核細(xì)胞B7的總表達(dá)水平均下調(diào)，DC總數(shù)量減少，DC1數(shù)量減少，DC2數(shù)量相對增加，DC2/DC1比例升高。G-CSF動員的PBSC與骨髓按2∶1～1∶2(單個核細(xì)胞數(shù)量比值)比例聯(lián)合移植，其免疫活性細(xì)胞趨于形成免疫耐受［3］。Huang等［4］和Lu等［5］的研究顯示，親屬HLA單倍體相合/部分相合移植體系中，急、慢性移植物抗宿主病(GVHD)發(fā)生率、受者的長期存活率及長期無病存活與同胞間HLA全相合移植的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。

1.3 國外HSCT基礎(chǔ)和臨床研究現(xiàn)狀 骨髓移植或HSCT是治療許多惡性血液病的有效方法，如各種急性血液病、骨髓增生異常綜合征、慢性中幼粒細(xì)胞白血病、嚴(yán)重的急性放射病、重癥再生障礙性貧血及部分其他血液系統(tǒng)惡性腫瘤(如惡性淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤)。

1.3.1 基礎(chǔ)研究:調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)功能與異基因造血干細(xì)胞移植(Allo-HSCT)，誘導(dǎo)免疫耐受取得進(jìn)展。Tregs是維系移植免疫耐受的必要細(xì)胞，可能參與GVHD預(yù)防以及淋巴細(xì)胞恢復(fù)重建的調(diào)控，美國國立衛(wèi)生院 (NIH)報道了T細(xì)胞去除的Allo-HSCT后的Tregs重建 －恢復(fù)動力學(xué)以及與GVHD的相關(guān)性［6-7］。Tregs特異性地表達(dá)Foxp3轉(zhuǎn)錄阻滯子(repressor)，通過測定Foxp3基因表達(dá)水平評估分析了Tregs CD4+CD25+Foxp3+細(xì)胞在移植后120 d內(nèi)的恢復(fù)動力學(xué)。研究結(jié)果提示，Tregs的抑制性作用與移植后GVHD的相關(guān)性更為密切。Tregs功能(通過Foxp3基因表達(dá)測定來評估)在控制移植后異源反應(yīng)性方面至為重要。這些結(jié)果支持在移植后30 d內(nèi)采用體外擴(kuò)增的Tregs CD4+CD25+Foxp3+細(xì)胞輸注以預(yù)防GVHD的設(shè)想。Rezvani等［8］和 Golshayan 等［9］報 道 了 Tregs CD4+CD25+輸注預(yù)防急性致死性GVHD，以及提高Allo-HSCT后免疫功能重建的效果。此前研究結(jié)果也已證實(shí)，Tregs CD4+CD25+可以降低主要組織相容性抗原(MHC)不合移植后實(shí)驗(yàn)小鼠的嚴(yán)重急性GVHD發(fā)生率，研究結(jié)果提示，Tregs能夠在提高淋巴細(xì)胞數(shù)量和功能恢復(fù)的同時防止GVHD的發(fā)生，從而確保了移植受體的存活。目前尚不清楚Treg細(xì)胞對效應(yīng)T細(xì)胞的作用是選擇性的還是非選擇性的，Treg細(xì)胞有可能在移植后個體體內(nèi)參與調(diào)節(jié)胸腺內(nèi)和外周血T淋巴細(xì)胞的成熟以及選擇過程。

有關(guān)HSC歸巢和植入的基礎(chǔ)研究取得進(jìn)展，由于移植的HSC數(shù)量有限(尤其是臍血移植)，其歸巢和植入對提高移植效果來說至關(guān)重要，HSC能經(jīng)由外周血?dú)w巢于骨髓并穩(wěn)定“居住”于骨髓微環(huán)境中，關(guān)于其分子機(jī)制的研究已經(jīng)取得進(jìn)展。HSC歸巢是一個組織非特異性的低效過程，各級造血細(xì)胞可能非特異性地隨血流分布并寄居于各組織器官，而僅歸巢于適宜造血微環(huán)境中的HSC能自我更新、增殖及分化［10］。不同來源的 HSC歸巢能力不同，骨髓及臍血CD34細(xì)胞穿越內(nèi)皮細(xì)胞能力顯著低于經(jīng)過動員的外周血CD34細(xì)胞;HSC歸巢能力還與供受者年齡有關(guān)，利用干細(xì)胞歸巢特性促進(jìn)HSCT過程中干細(xì)胞歸巢與植入，歸巢特性為臨床采集HSC也提供了新思路。

1.3.2 臨床研究:國外近年來通過使用兔抗人胸腺細(xì)胞免疫球蛋白(ATG)、氟達(dá)拉濱(Flud)、甲潑尼龍和全身照射使HLA單倍型骨髓移植排斥率由40%降到 5% 以下［11］。Mehta 等［12］報告 210 例用ATG預(yù)處理后植入率是97%，在預(yù)防GVHD方面，體外加抗體T10B9，選擇性去除引起GVHD的T細(xì)胞，移植后使重度GVHD發(fā)生率由70%降至10%～20%，臨床經(jīng)驗(yàn)支持去除T細(xì)胞有利于單倍型移植的成功。Aversa研究小組應(yīng)用大劑量CD34細(xì)胞與相對低毒性的ATG、Flud、塞替派，使90%以上患者持續(xù)植入，1個月內(nèi)移植相關(guān)病死率為10%［13］;2005年臨床研究評價101例 HSCT結(jié)果［14］，94例穩(wěn)定植入，在緩解狀態(tài)的急性髓細(xì)胞性白血病(AML)和急性淋巴細(xì)胞性白血病(ALL)移植后無病生存率是48%和46%，改善了白血病的不良預(yù)后。

2 我軍HSCT發(fā)展現(xiàn)狀及研究成果

2.1 本學(xué)科技術(shù)發(fā)展現(xiàn)狀 北京軍區(qū)總醫(yī)院80年代初就在臨床成功開展HSCT技術(shù)，是全國較早開展該項(xiàng)技術(shù)的單位之一，經(jīng)過二十多年的努力奠定了很好基礎(chǔ)。配型相合的同胞和非血緣關(guān)系A(chǔ)llo-HSCT，具有并發(fā)癥少等優(yōu)點(diǎn)，移植成功率為85% ～95%。單倍型移植(父母為子女、子女為父母、同胞間)具有突破性進(jìn)展，改良預(yù)處理方案避免過強(qiáng)的不良反應(yīng)，建立G-CSF動員骨髓調(diào)節(jié)免疫功能的HSCT方法，臨床效果顯著［15-16］。國內(nèi)首次報告不去除T細(xì)胞單倍型移植免疫重建明顯快于去除T細(xì)胞移植，減少移植后感染。我們對128例HLA半相合移植，用全身照射10 Gy劑量，加用ATG和阿糖胞苷(Ara-C)預(yù)處理，127例植入成功。首先提出了抗白介素-2α(IL-2α)受體單抗在HLA半相合移植中可有效預(yù)防GVHD。Kaplan-Meier生存曲線計算2年無病存活率達(dá)58.2%，2年實(shí)際無病生存率是46.6%。復(fù)發(fā)狀態(tài)和進(jìn)展期移植的患者2年無病生存率是 30.6%，標(biāo)危組移植后生存率是65.5%，差異具顯著性意義，增加病例數(shù)的研究更加肯定了CD25抗體預(yù)防GVHD效果，首次得出了長期隨訪的病例報告［17］。國際上最完整的，最大數(shù)量的報告了單倍型移植效果，在移植存活率、GVHD發(fā)病率和移植相關(guān)病死率方面與HLA全相合移植無差異。Chen等［18］在跨越HLA不合植入屏障方面的研究取得進(jìn)展，研究結(jié)果發(fā)表在國際權(quán)威《Exp Hematology》雜志，代表我國在亞太國際骨髓移植會議做專題報告，得到國內(nèi)外學(xué)者肯定，在該領(lǐng)域居于國內(nèi)領(lǐng)先地位，獲得中華醫(yī)學(xué)、軍隊(duì)醫(yī)療和北京市科技成果等獎項(xiàng)，對開拓移植骨髓源起到重要作用。我軍區(qū)重視科研創(chuàng)新，已多次開展包括二次單倍型移植的高難度移植手術(shù)，術(shù)后均獲得滿意的療效，屬國內(nèi)首次報道，在治療難治性復(fù)發(fā)性白血病方面建立了初步方法。

2.2 全軍開展造血干細(xì)胞研究的成果 全軍在基礎(chǔ)研究和臨床工作方面成績十分突出，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院、解放軍307醫(yī)院和解放軍總醫(yī)院基礎(chǔ)研究都有進(jìn)展。解放軍307醫(yī)院開展間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)在移植中的應(yīng)用。MSCs是一種具有自我更新和多向分化潛能的成體干細(xì)胞，存在于骨髓、脂肪組織、臍血及多種胎兒組織，可分泌多種細(xì)胞因子及生長因子，促進(jìn)HSC的增殖與分化，MSCs還具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎和組織修復(fù)作用，可減輕GVHD及其他移植相關(guān)并發(fā)癥，在臨床預(yù)防和治療GVHD方面已經(jīng)取得成績［19-20］。喬建輝等［21］探索放射病救治基礎(chǔ)和臨床工作，建立軍隊(duì)放射病研究所，報告了Allo-HSCT治療重度骨髓型急性放射病的效果，為骨髓型急性放射病的治療提供方法。全國每年完成Allo-HSCT 1500～2000例，其中軍隊(duì)醫(yī)院完成1000例，且非血緣移植和配型不合移植技術(shù)，處在國內(nèi)領(lǐng)先地位。放射病治療的核心是放射后造血重建，解放軍307醫(yī)院成立全軍放射病研究所，多次承擔(dān)核輻射事故的搶救工作，在放射病救治方面為國內(nèi)療效最好的單位，多次獲得上級表彰。

3 北京軍區(qū)HSCT技術(shù)發(fā)展思考

3.1 深入開展臨床工作 目前能夠開展HSCT技術(shù)的是北京軍區(qū)總醫(yī)院和解放軍白求恩國際和平醫(yī)院，該技術(shù)復(fù)雜，需要投入經(jīng)費(fèi)和提高醫(yī)院整體技術(shù)水平，北京軍區(qū)總醫(yī)院在單倍型移植方面有特色，將繼續(xù)開展單倍型移植臨床工作，提高難治性復(fù)發(fā)性白血病治療效果。該項(xiàng)工作在國內(nèi)首先開展，具有理論基礎(chǔ)，取得了學(xué)術(shù)地位。由于重復(fù)性好，單倍型移植工作仍在延續(xù)中。本?？婆R床上每年完成Allo-HSCT 100例左右，是國內(nèi)較大的開展HSCT的單位之一，其中2/3是半匹配Allo-HSCT，為難治性復(fù)發(fā)性白血病的治療提供新途徑。

3.2 加強(qiáng)學(xué)術(shù)科研工作 重點(diǎn)圍繞臨床診治中迫切需要解決的問題進(jìn)行應(yīng)用性基礎(chǔ)和臨床研究，形成了鮮明的醫(yī)療特色和醫(yī)、教、研相互促進(jìn)的良性循環(huán)發(fā)展模式。增加誘導(dǎo)免疫耐受的工作，特別探討Tregs的抑制性與移植后GVHD的相關(guān)性。研究移植后復(fù)發(fā)預(yù)防的基礎(chǔ)研究，預(yù)處理、移植免疫、移植物抗白血病效應(yīng)，改善白血病預(yù)后。在現(xiàn)有經(jīng)費(fèi)、設(shè)備和條件下，積極增加投入，改善實(shí)驗(yàn)室研究條件，加強(qiáng)與國外領(lǐng)先單位合作，提高基礎(chǔ)研究水平，建立理論根據(jù)，每年發(fā)表高水平論文5～10篇，爭取建成全軍?？浦行?。

3.3 技術(shù)和科技建設(shè) 確定研究方向和內(nèi)容，努力實(shí)現(xiàn)以下目標(biāo)的研究，建立更加完善的臍帶血移植方法，相對于骨髓移植發(fā)生移植排斥的危險性小，在早期造血及免疫系統(tǒng)恢復(fù)延遲，但移植后復(fù)發(fā)率及移植相關(guān)病死率兩者無明顯差異。國外研究資料顯示，臍帶血在移植領(lǐng)域有很好應(yīng)用前景，臍帶血移植在兒童患者中的應(yīng)用已被證實(shí)是成功的，目前，臍帶血移植的應(yīng)用領(lǐng)域也在逐步擴(kuò)展，成功用于成人并取得肯定的療效，為臨床實(shí)踐的進(jìn)步建立理論基礎(chǔ)［22-23］。研究NK細(xì)胞及KIR分子植入與抗復(fù)發(fā)問題，對提高單倍型相合移植療效有重要意義。單倍型移植是治療難治性復(fù)發(fā)性白血病最有效方法，但是復(fù)發(fā)性白血病移植后仍存在較高復(fù)發(fā)率，特別是淋巴細(xì)胞白血病。KIR為狹義Ig超家族分子，表達(dá)在NK細(xì)胞和部分T細(xì)胞表面，可與靶細(xì)胞表面的MHC I類分子結(jié)合，傳導(dǎo)激活或抑制信號。移植后T細(xì)胞的免疫識別分為直接識別和間接識別［24］，即T細(xì)胞根據(jù)分子模擬原理直接識別同種異體的HLA分子和間接識別自體APC細(xì)胞上提呈的同種異體抗原。繼續(xù)深入探討NK細(xì)胞與移植后復(fù)發(fā)的關(guān)系，進(jìn)一步研究KIR分子檢測與療效關(guān)系，尋找預(yù)防移植后復(fù)發(fā)的方法。單倍型骨髓移植越來越受到全世界血液病專家的重視，雖然目前其發(fā)展現(xiàn)狀尚不能與全相合的骨髓移植相提并論，但從發(fā)展趨勢看完全有可能在惡性血液病的根治方面占有更重要的地位。廣泛開展移植后G-CSF動員PBSC的應(yīng)用研究，闡明GVHD和GVL分離的理論基礎(chǔ)。

3.4 為我國軍事醫(yī)學(xué)作貢獻(xiàn) HSCT技術(shù)的軍事學(xué)特征在于對放射病的治療。隨著核技術(shù)的發(fā)展以及核擴(kuò)散危險的日益緊迫，與之相關(guān)的放射病會因此呈現(xiàn)暴發(fā)趨勢，因此，軍隊(duì)醫(yī)院尤其應(yīng)重視HSCT臨床治療和基礎(chǔ)研究工作，解決受照后移植的時機(jī)，用全身照射模型評估照射劑量的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo);免疫抑制劑的調(diào)整;并發(fā)癥防治，移植后重度GVHD、植入物排斥和間質(zhì)性肺炎等問題。

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