高等植物花發(fā)育的分子生物學研究

廖志琴，程 華，李琳玲，程水源

(1.武漢工程大學 化工與制藥學院，湖北 武漢430074;2.經(jīng)濟林木種質(zhì)改良與資源綜合利用湖北省重點實驗室/化學與生命科學學院，湖北 黃州438000)

高等植物的花發(fā)育，是其生長發(fā)育過程中的重要階段，也一直是一個重要的研究方向。對于植物花發(fā)育的研究，起初僅局限于形態(tài)分化和生理生化兩方面，對其分子生物學方面的研究不過開始于二十世紀九十年代。一般以AG、DEF 和FLO 基因分別從擬南芥和金魚草中成功分離出來，作為花發(fā)育研究進入分子水平的標志。目前的研究不止在模式植物中取得巨大成功，也在果樹，林木等大型植物上取得相當可觀的進展，但不同物種之間研究進展差異很大。

1 花發(fā)育的特點

花芽分化是植物由營養(yǎng)生長向生殖生長轉(zhuǎn)變的過程，是指植物莖生長點由分生出葉片，腋芽轉(zhuǎn)變?yōu)榉只龌ㄐ蚧蚧ǘ涞倪^程。植物的花發(fā)育一般被分為開花誘導、花的發(fā)端和花器官發(fā)育3 個階段，是由多基因調(diào)控的十分復雜的過程［1，2］。開花誘導是植物生殖生長的第一個階段，這一階段，植物的頂端分生組織由營養(yǎng)生長向生殖生長轉(zhuǎn)變，是主要以成花基因的啟動為主要特點的生理生化過程，這一過程主要受光周期促進、春化促進、自發(fā)促進、開花抑制和赤霉素誘導等多個途徑的共同控制［3，4］。該階段植物的莖頂端分生組織在形態(tài)上并沒有發(fā)生變化。植物開花途徑整合基因的表達激活花/花序分生組織特異基因，導致莖頂端分生組織向花序(花)分生組織轉(zhuǎn)變，形成花序(花)分生組織，這一過程稱為花的發(fā)端。由于花序/花分生組織特異基因的表達，激活了花器官特異基因，從而形成花器官，完成花器官的發(fā)育。

對于某些木本果樹的花發(fā)育，有一個花芽孕育臨界時期確定的問題。研究發(fā)現(xiàn)，木本果樹花芽孕育與新梢停止生長有關，黃海、曹尚銀［5］用標記同時停止生長的短枝研究證明蘋果花芽孕育臨界時期從著生這個芽的枝條停止生長開始，一直持續(xù)到花芽形態(tài)分化開始，這段花芽孕育所必須的時間稱之為“花芽孕育的臨界時期”。若完成花芽孕育的時間得不到滿足，花芽就不能形成，而一旦形成花芽就不可逆轉(zhuǎn)，且臨界時期有品種，地區(qū)差異。

2 開花誘導的4 個遺傳途徑

植物在不同的生活環(huán)境中進入花發(fā)育的狀態(tài)受不同途徑的誘導，因物種種類不同而有差異，且同種植物也會有開花備選途徑。前人認為高等植物的開花轉(zhuǎn)換是一個此消彼長的過程，促進和抑制物質(zhì)的分布及數(shù)量的調(diào)整影響著植物花發(fā)育的過程。對擬南芥的一系列研究成果表明，開花主要是一個體內(nèi)抑制狀態(tài)在環(huán)境因子和體內(nèi)發(fā)育信號的誘導下逐漸解除的過程，解除方式可能要通過多種途徑進行。促進植物開花的主要途徑包括光周期途徑、春化途徑、自主途徑和赤霉素途徑，植物需要整合各途徑的發(fā)育信號且在體內(nèi)傳遞到達頂端生長點，才能開啟花的發(fā)育過程。

2.1 光周期途徑

光對植物花發(fā)育的影響主要有光照時間和光質(zhì)(光的波譜組成)兩方面。嫁接、去葉等光周期誘導研究試驗發(fā)現(xiàn)，植物對光周期反應的部位是葉片，其產(chǎn)生成花刺激物經(jīng)韌皮部運往莖尖，開啟花原基的發(fā)育，光周期途徑包括葉片對光信號的捕捉、晝夜節(jié)律的推動以及移動信號的產(chǎn)生和傳導［6］。在擬南芥突變體的研究中已克隆了很多光周期依賴的基因，包括GI、FD、FHA、FT、TOC1、LHY、CCA1 和ELF3 等。TOC1、LHY、CCA1 是影響晝夜節(jié)律的基因［7］，GI 是調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律鐘和開花時間的一個關鍵因子［8］，它分別通過CO 途徑和miR172 途徑誘導FT 表達，兩途徑在長日照下共同促進開花［6］。CO 和FT 都在葉片中表達，F(xiàn)T蛋白可進入篩管，再運輸?shù)角o頂端分生組織，與bZIP 類轉(zhuǎn)錄因子FD 蛋白組成復合體，從而激活AP1 和SOC1，SOC1 直接結(jié)合LFY 啟動子，促進LFY 表達［9］。由于FT 蛋白可以移動，且在不同物種中相似，已證明FT 蛋白就是成花素組分之一［10］，目前已在多種果樹中克隆到其同源基因［11，12］。ELF3 負調(diào)控GI 蛋白量［13］。

2.2 春化途徑

春化作用主要通過抑制FLC 的活性來促進開花，F(xiàn)LC 蛋白屬于MADS －box 蛋白，可維持芽頂端的營養(yǎng)狀態(tài)［9］。FRI 和SUF4 蛋白結(jié)合成復合體，連接到FLC 的啟動子上促進FLC 的表達。低溫可誘導VIN3 的表達，該基因與組蛋白去乙酰化有關，能抑制FLC 的轉(zhuǎn)錄，VRN2 復合體促成FLC 染色質(zhì)的異染色質(zhì)化［14］，減少FLC 的轉(zhuǎn)錄，而VRN1 參與對FLC 染色質(zhì)區(qū)域的甲基化作用［15］。FLC 蛋白可結(jié)合到FD 的翻譯起始位點上游、SOC1 的啟動子上以及FT 的第一個內(nèi)含子上，抑制這些基因的表達［16，17］，但對FT 的抑制作用是間接形成的。在擬南芥中，春化作用能夠維持FLC 表達的抑制狀態(tài)，直到花粉第二次有絲分裂的S 期才可能回到正常的表達狀態(tài)［9］，因此，子代植株須重新進行春化處理。蘋果、葡萄、枳等果樹中已有春化作用途徑相關基因的報道，在一種早實枳突變體中分離得到了FLC 基因PtFLC，它抑制開花，且表達分析顯示，PtFLC 在冬天上調(diào)表達，在春、夏天則下調(diào)表達［18］。

2.3 自主途徑

當缺乏環(huán)境因子(低溫、光照)的誘導，植物在營養(yǎng)生長達到一定階段后也會開花，至今還沒有發(fā)現(xiàn)在擬南芥的眾多突變體中有不開花的，這種植物內(nèi)部控制開花的途徑稱為自主途徑。這些開花基因包括FY、FLK、FCA、FPA、LD、FLD 和FVE，在長日照或短日照條件下總是促進開花，且它們彼此之間互不調(diào)控基因表達，也不產(chǎn)生級聯(lián)放大效應，而是以平行的方式發(fā)揮作用。自主途徑主要通過控制FLC 的表達來促進植物開花，并且通過不同的分子機制調(diào)控FLC 的表達［19］。

2.4 赤霉素途徑

GA 在短日照條件下可誘導擬南芥LFY 和SOC1 的表達，從而促進開花。赤霉屬可能通過啟動子上類似于MYB 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的序列調(diào)節(jié)LFY 基因的表達［20］，AtMYB33 是miR159 的一個目標基因，miR159 在短日照下負調(diào)控At-MYB33［21］，AtMYB33mRNA 被剪切，LFYmRNA 減少，開花延遲。GA 的合成場所是在新生組織中，這也是GA 調(diào)控反應的位點，GA 可從葉運輸?shù)角o頂端，誘導開花，GA 合成的關鍵酶為GA20ox，編碼此酶的5 個基因(GA20ox1 ～5)的表達受活性GA 的負調(diào)控，也受到外界環(huán)境信號的調(diào)控。長日照處理可以誘導GA20ox 編碼基因的表達，從而促進開花［22］。GA 調(diào)控的具體機理還有待人們進一步研究。

在開花誘導過程中，各途徑的基因效應最終都整合到了幾個關鍵基因:FT、LFY、SOC1 和FLC，這些基因?qū)崿F(xiàn)對植物開花時間的調(diào)控，其中，LFY 也是花序分生組織特異基因。春化作用和光周期途徑能整合環(huán)境信號和內(nèi)源發(fā)育程序，分別在低溫處理和長日照下促進開花，赤霉素(GA)在非誘導短日照下促進開花，自主途徑在所有的條件下調(diào)控開花。

3 花/花序分生組織形成

植物開花途徑整合基因的表達激活花/花序分生組織特異基因，如FUL、CAL、LFY 和AP1 等，從而形成花序(花)分生組織，這一過程稱為花的發(fā)端。AP1 在花器官發(fā)育中還控制萼片和花瓣的發(fā)育。在擬南芥中，LFY 和AP1 的作用是使花序分生組織側(cè)面形成的原基發(fā)育為花，而不是葉芽，兩基因的單突變體表型為花向葉芽的部分轉(zhuǎn)變［23］。AP1 的功能與LFY 部分冗余，其表達時期晚于LFY，兩者具有加合效應，能相互促進表達［24］。CAL 與AP1 同源性很高，屬于MADS 盒基因，表達模式也與AP1 相似［25］。

楊樹作為木本模式樹種，其LFY 同源基因在花芽發(fā)育過程中的表達模式為:以毛白楊為例，PtLFY 在毛白楊雌雄花芽中持續(xù)穩(wěn)定表達，但該基因在雄花芽中的相對表達量明顯高于雌花芽，解剖分析結(jié)果表明，雄花芽形態(tài)分化進程明顯早于雌花芽，這種差異可能與PtLFY 在雌雄花芽發(fā)育過程的差異表達存在密切聯(lián)系［26］。

提高植物的花/花序分生組織特異基因的表達量，也能夠促進其提早開花，如安利忻［27］將擬南芥的AP1 基因克隆入植物中間載體p208，通過根癌土壤桿菌介導的方法轉(zhuǎn)化矮牽牛，得到的兩個株系的轉(zhuǎn)基因矮牽牛在R0 代即表現(xiàn)出提前且持續(xù)不斷地開花的特性，與對照差異顯著。呂晉慧等［28］將AP1 基因轉(zhuǎn)入“玉人面”地被菊，使之提早開花。垂枝樺中FUL 的同源基因BpMADS4和BpMADS5 在煙草中過量表達時會使轉(zhuǎn)基因植株開花大大提前，其中BpMADS4 與FUL 的同源性最高，且在花、芽和根中均表達;BpMADS5 則在花和未成熟果實中特異表達，F(xiàn)lachowsky［29］等將垂枝樺的BpMADS4 基因在蘋果中超量表達，結(jié)果使蘋果開花提前。

4 花器官發(fā)育

植物花器官的發(fā)育由花器官特異基因控制，在某一細胞中特定的基因組合可決定其發(fā)育形態(tài)。種子植物的成年花器官由花萼、花瓣、雄蕊、雌蕊(心皮)等四輪結(jié)構(gòu)組成，花器官排列成向心的圓環(huán)形，稱作輪性。野生型金魚草和擬南芥的花由四個花萼組成最外側(cè)的第一輪，依次向內(nèi)為四個花瓣組成第二輪，六個雄蕊組成第三輪，兩個融合的心皮組成第四輪?；趯M南芥和金魚草的各類花器官同源異型突變體的研究，研究者發(fā)現(xiàn)了一系列調(diào)控花器官形成的器官特征基因，1991 年Coen 在此基礎上提出花器官特征決定的“ABC”模型，該模型認為被子植物的四輪花器官由具有不同功能活性的A、B、C 三類基因決定，A類基因單獨作用決定萼片的特征，A 和B 類的共同作用決定花瓣的形成，B 和C 類共同作用決定雄蕊的產(chǎn)生，C 類基因單獨作用決定心皮的特征。此外，A 基因和C 基因相互拮抗。

從擬南芥中克隆得到的基因中，AP1 和AP2屬于A 類基因，在花器官的第一和第二輪中表達，AP3，PI 為B 類基因，在第二和第三輪花器官中表達，AG 屬于C 類基因，在第三、四輪花器官中表達［30］。

在藍桉中已經(jīng)克隆到AP1 的同源基因EAP1和EAP2，它們主要在花芽內(nèi)表達。此外，在未成熟的蓋瓣和花托內(nèi)也有表達。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將EAP1 和EAP2 轉(zhuǎn)接到擬南芥中，發(fā)現(xiàn)其過量表達與AP1 的過量表達結(jié)果相似，且轉(zhuǎn)基因植株提前開花［31］。

小黑楊中分離得到的AP1 同源基因XxAP1，在花器官原基形成和花器官分化時期持續(xù)穩(wěn)定表達，在花器官生長時期表達量有下調(diào)趨勢［32］。

Nilsson 等［33］從挪威云杉中分離出3 個與擬南芥AP2 同源的基因，包括PaAP2L1、PaAP2L2和PaAP2L3。這3 個基因的表達模式各有不同。在擬南芥中過量表達PaAP2L2 會阻礙植株的生長，在第3、4 輪花器官中雌雄蕊的數(shù)目有所增加，且開花有所推遲。在擬南芥ap1 突變體中過量表達PaAP2L2，可促進花瓣特征的決定，說明它們有與AP2 基因功能相似的作用。

張彥峰等［34］在蕓苔屬雄蕊心皮化雄性不育系分子機理研究中發(fā)現(xiàn)有2 類AP3 基因(BAP3和BAP3 －24)共同調(diào)控蕓苔屬植物花瓣和雄蕊的發(fā)育。BAP3 和BAP3 －24 基因高度同源，但兩者的功能卻顯著不同，BAP3 具有形成花瓣、雄蕊的雙重功能，而BAP3 －24 僅具有形成雄蕊的功能和促進萼片化花瓣發(fā)育的劑量效應。

侯計華［35］在果梅中克隆到AG 基因，發(fā)現(xiàn)AG 基因主要在果梅的萼片、雄蕊、雌蕊、果皮和種子能檢測到，且表達量較高，但是在葉片以及花器官的花瓣中不表達，比較轉(zhuǎn)AG 基因煙草與對照的植株大小，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因的煙草植株與對照相比，雄蕊中的花藥低于雌蕊或與雌蕊齊平，而且花瓣顏色變成了淺粉色。

在矮牽牛中，F(xiàn)BP7(floral binding protein7)和FBP11 (floral binding protein11)從胚珠原基起始到胚珠成熟的過程中都有表達，當轉(zhuǎn)基因共抑制FBP7 和FBP11 基因后，導致胚珠被同源異型化，轉(zhuǎn)變?yōu)樾钠せ慕Y(jié)構(gòu)［36］。這說明 FBP7 和FBP11 是控制胚珠發(fā)育的基因。經(jīng)研究表明胚珠的發(fā)生是獨立于心皮的。擬南芥中也有一些基因與C 類基因同源性較高，但功能有所不同［37］，如SHP1 和SHP2，在心皮和果實中特異表達，在胚珠中特異表達的還有AGL11 和AGL13 基因，它們一起被歸為D 類基因，D 類基因控制胚珠的發(fā)育。

在擬南芥中還有一類基因，SEPALLATA1、SEPALLATA12、SEPALLATA13，它們的基因序列高度相似，并且功能密切相關［38］，SEP1 和SEP2基因在四輪花器官中均有表達，且在各花器官原基中起始表達早于AG、AP3 和PI。而SEP3 僅在花瓣、雄蕊和雌蕊中表達。B 和C 類功能基因的活性需要SEP 的參與，繼而將SEP1/2/3 基因命名為E 類基因，E 功能基因參與控制花瓣、雄蕊、心皮和胚珠的發(fā)育［39］。SEP4 (SEPALLATA4)，在萼片、花瓣、雄蕊和心皮四輪花器官中均表達，SEP4 單突變體無表型變化，sep1sep2sep3sep4 四重突變體的花同源異型轉(zhuǎn)化為葉片類器官，E 類基因的功能擴展到第一輪，表明E 功能基因參與調(diào)控四輪花器官和花分生組織的決定性［40］。王靜澄等［41］在毛白楊中得到SEP3 基因啟動子的部分序列，序列分析結(jié)果表明該序列具有啟動子的基本元件TATA－box 和CAAT－box，還包含大量光響應元件ACE、Box I 和Box 4 等，此外還有脫落酸響應元件ABRE，赤霉素響應元件GARE －motif 以及脅迫響應元件HSE、TC － rich repeats等，為該基因啟動子的研究奠定基礎。

對植物花發(fā)育分子生物學的研究成果倍出，主要集中在花發(fā)育相關基因序列的克隆，基因功能和表達分析，啟動子序列獲得以及轉(zhuǎn)基因研究。模式植物，如擬南芥、金魚草、楊樹的開花基因研究比較全面，近年來在果樹，林木等木本植物中開花基因的研究成為熱點，研究經(jīng)濟林木成花基因，可為縮短經(jīng)濟林木童期、實現(xiàn)花芽分化調(diào)控、提高木本果樹果實品質(zhì)和產(chǎn)量提供依據(jù)，但在這些方面還有很長的一段路要走，各種研究仍在艱難的探索中。

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