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    梨屬植物中天然活性物質(zhì)的研究進展

    2013-08-15 00:45:35曲建輝楊越冬
    河北科技師范學院學報 2013年3期
    關鍵詞:杜梨刺梨多糖

    曲建輝,杜 彬,楊越冬

    (河北科技師范學院,河北秦皇島,066004)

    梨屬(Pyrus L.)植物屬于薔薇科(Rosacease)梨亞科(Pomoidease)。我國現(xiàn)有梨屬植物14種,主栽系統(tǒng)有砂梨、白梨、秋子梨和新疆梨等,多分布在華北、東北、西北及長江流域各?。?]。梨始載于《名醫(yī)別錄》,有著悠久的藥用歷史,其味甘、微酸,性涼,果、皮、葉、花、根均可入藥,有潤燥、生津、清熱、化痰等功效[2]?!吨腥A本草》中收錄有刺梨的果實、根和葉,鹿梨的果實和根皮,棠梨的果實和枝葉等作為藥用[3]。近年來醫(yī)學研究也發(fā)現(xiàn)梨有止咳、消炎、利尿、降血壓等作用[4~6]。研究表明,從梨果肉、汁、皮、葉和核中分離出多種活性物質(zhì),主要包括多酚類、三萜類、甾醇類、黃酮類、多糖類、揮發(fā)油等物質(zhì)。隨著天然產(chǎn)物化學成為研究熱點,梨屬植物中天然活性物質(zhì)的研究越來越受到專家學者的關注。本研究綜述了梨屬植物天然活性物質(zhì)的提取方法、分離純化、化學成分和生理活性等方面研究,并提出其應用展望。

    1 提取方法

    目前對于梨屬植物天然活性物質(zhì)的提取方法研究較多,已經(jīng)由傳統(tǒng)的提取方法逐漸轉(zhuǎn)向新的提取技術。主要有溶劑提取法、超聲循環(huán)提取法、超高壓提取法和超臨界流體萃取法等。

    1.1 溶劑提取法

    溶劑回流提取法是一種傳統(tǒng)的提取方法,具有減少溶劑消耗,提高提取率[7]等特點,因此近年來報道比較多。

    劉旭輝等[8]采用溶劑回流法提取豆梨中多糖類物質(zhì),通過正交試驗,得到最佳工藝條件:浸提劑用量為15 mL/g(即1 g原料所用的浸提劑為15 mL,以下同),提取溫度95℃,提取時間2 h,平均提取率3.04%。趙小亮等[9]通過研究杜梨果實中多糖類物質(zhì),采用溶劑回流法和正交試驗設計,得出最佳提取工藝:浸提劑用量為15 mL/g,提取溫度90℃,提取時間5 h,平均提取率為18.65%。查慧領等[10]采用溶劑回流法,通過正交試驗對青海軟兒梨中黃酮類物質(zhì)進行提取,最佳提取條件為:乙醇體積分數(shù)為0.95,浸提劑用量為30 mL/g,提取溫度80℃,提取時間3 h,總黃酮在軟兒梨中的質(zhì)量分數(shù)為0.000 189。

    該提取方法雖然提取率比較高,但提取時間長,成本高,雜質(zhì)含量高,料液長時間受熱,很容易破壞其中的有效成分。

    1.2 超聲循環(huán)提取法

    超聲循環(huán)提取法也就是傳統(tǒng)的超聲提取技術,最大的優(yōu)點是:提取時間短、溫度低、提取率高,一般在室溫下操作,室溫提取可以保護有效成分不被破壞[11]。

    趙玉卉等[12]采用超聲-微波協(xié)同萃取法和常規(guī)水浴法提取杜梨多糖,結果表明,超聲-微波協(xié)同萃取法比常規(guī)水浴法提取杜梨葉片多糖效果更好,兩種方法提取多糖的質(zhì)量分數(shù)分別是0.215 2和0.104 1,因此,超聲-微波協(xié)同萃取法可作為杜梨葉片多糖提取的首選方法,但微波提取時間長活性物質(zhì)容易被破壞,應控制微波提取時間。

    1.3 超高壓提取法

    超高壓提取法遵循Pascal原理,即利用100~1 000 MPa的壓力,輔助以水或油作為壓力媒體,使壓力瞬間均勻傳遞。超高壓提取法的優(yōu)點是:提取率高,耗時短,不會使活性物質(zhì)結構發(fā)生變化。

    馬佩佩等[13]以庫爾勒香梨為原料,采用超高壓提取法篩選提取多糖類物質(zhì)的最佳工藝條件為:壓力300 MPa,溫度35℃,浸提劑用量3 mL/g,保壓時間5 min,多糖得率為4.34%。同微波法和常規(guī)水浴提取方法相比,超高壓提取方法提取率高,提取時間短,不會破壞有效的活性成分,是提取香梨多糖的最佳方法,但對于不同原材料所需的壓強還需進一步研究。

    1.4 超臨界流體萃取法

    超臨界流體萃取(SCFE)技術是可以通過調(diào)節(jié)系統(tǒng)的溫度和壓力來調(diào)節(jié)對成分的溶解度,適用于熱敏性、易氧化的有效成分提取,其優(yōu)點是:提取率高,環(huán)保無污染,耗能低,不會造成有效成分的破壞。

    婁在祥等[14]采用超臨界CO2萃取法提取庫爾勒香梨中的精油,與水蒸氣蒸餾法、固相微萃取法相比,超臨界CO2萃取法的提取率最高,為0.054 9%。結果表明,水蒸氣蒸餾法設備簡單,操作方便,成本低,但提取溫度較高、時間較長,產(chǎn)物易損失。固相微萃取法分析時間短、不使用有機溶劑、樣品用量少,不適合用于精油提取。超臨界CO2萃取法,由于CO2的臨界溫度(Tc=31.05℃)易于達到,可在室溫對天然植物的有效成分進行提取,并且得率也最高。

    2 分離純化

    在天然活性物質(zhì)研究中,分離純化是一門很重要的關鍵技術,樣品的純度影響著樣品性質(zhì)的測定和結構的分析。分離純化方法包括溶劑萃取法,柱層析法,高效液相色譜法(HPLC)等。

    2.1 柱層析法

    層析法又稱色譜分析法或色譜法,是目前最常用的分離技術,具有高分離效能、高檢測性能、分析時間快[15,16]等優(yōu)點。該方法可用于天然產(chǎn)物的分離制備,被廣泛應用于化學、食品、化工、醫(yī)藥和生化等領域,目前關于分離三萜類、黃酮類、多酚類、生物堿類等物質(zhì)的研究有很多相關報道。

    對庫爾勒香梨多糖的粗提物進行醇沉后,用正丁醇、質(zhì)量濃度為0.20的三氯乙酸以及正丁醇-質(zhì)量濃度為0.20的三氯乙酸法去除蛋白,通過DEAE-52柱層析純化后,采用Sephadex G-100凝膠柱層析后,證實其為單一組分。研究表明,醇沉后的多糖采用正丁醇-質(zhì)量濃度為0.20的三氯乙酸去除蛋白效果最佳,其多糖損失率為34.85%,蛋白質(zhì)去除率為13.75%[17]。

    大孔樹脂吸附純化是20世紀70年代發(fā)展起來的一種新型純化方法,在天然產(chǎn)物的分離純化中廣泛應用,具有吸附容量大、易再生、穩(wěn)定可靠等諸多優(yōu)點,是分離純化三萜類、黃酮類、多糖類等物質(zhì)的重要方法[18]。

    劉延吉等[19]通過對吸附率及解吸率的測定,確定最佳大孔樹脂型號、靜態(tài)和動態(tài)吸附及解吸條件。結果表明,AB-8型大孔樹脂的吸附性能最佳,其最佳靜態(tài)吸附條件為:pH 5.4,質(zhì)量濃度1.02 g/L,溫度25℃,吸附時間3 h,吸附率65%以上,解吸率75%以上;最佳動態(tài)解吸條件為:上樣流速1.0 mL/min,解吸流速2.0 mL/min,體積分數(shù)為0.50的乙醇為三倍柱床體積,解吸率達80.24%。

    柱層析技術設備簡單,成本也較低,但分離速度較慢,需要進行反復的分離純化才能達到目的。

    2.2 高效液相色譜法(HPLC)

    高效液相色譜法分析速度快、范圍廣、分離效能高,世界各國已經(jīng)將此法收載于藥典中[20~23]。其分離模式與檢測方法有很多種,可以根據(jù)樣品的構成及性質(zhì)來選擇比較好的色譜條件(色譜柱、流動相、檢測器等)。該方法簡便、準確、重現(xiàn)性好,已廣泛用于天然產(chǎn)物活性成分的樣品制備中。

    Shahaboddin等[24]利用高效液相色譜研究Pyrus biossieriana Buhse梨葉提取物。其色譜條件為:Prontosil#60-5 C18色譜柱(250 mm × 4.6 mm,5 μm);流動相為V甲醇∶V水∶V乙腈=50∶50∶1;流速0.7 mL/min;室溫;檢測波長286 nm;進樣量20 μL;采用峰面積外標法定量。Dilek和Aziz[25]采用高效液相色譜對7個不同品種的梨汁中的多酚類物質(zhì)進行了分析,結果表明:綠原酸的質(zhì)量濃度范圍是73.1~249.0 mg/L,表兒茶素是 11.9~81.3 mg/L,咖啡酸是2.4~11.4 mg/L,對香豆酸是0.0~3.0 mg/L。王慧等[26]建立了同時測定中藥刺梨中楊梅素和槲皮素含量的HPLC分析方法,色譜條件為:Zorbax SB-C18色譜柱(150 mm ×4.6 mm,5 μm),流動相 MeOH-H3PO4(MeOH 與 H3PO4體積比為 47∶53),流速 1.0 mL/min,檢測波長368 nm,柱溫30℃,進樣量為10 μL。結果表明:楊梅素和槲皮素含量分別在0.036 2~0.253 7 μg,0.056 ~0.196 μg,平均加樣回收率分別為 98.32%,98.84%,RSD 分別為 2.18%,1.78%,峰面積與濃度呈良好的線性關系(r=0.999 9)。

    3 梨屬植物化學成分

    近年來,波譜技術在梨屬植物天然活性物質(zhì)的結構分析中得到了廣泛的應用,多酚類、三萜類、甾醇類、黃酮類、多糖類、揮發(fā)油等活性物質(zhì)已經(jīng)被越來越多的科學工作者探索研究。

    3.1 多酚類物質(zhì)

    韓國學者Lee等[27]利用ESI-MS和NMR技術,從亞洲梨(Pyrus pyrifolia Nakai cv.Chuhwangbae)的梨皮中分離得到8種多酚類物質(zhì),其中化合物4-(O-β-D-葡萄糖基)-3-(3'-甲基-2'-丁烯基)苯甲酸和Z-綠原酸在梨屬植物中首次被發(fā)現(xiàn),其他的化合物分別為:熊果苷,3-二羥基苯甲酸,E-綠原酸,異鼠李素3-O-β-D-葡萄糖苷,3,5-二咖啡??鼘幩?,(-)-表兒茶素。

    Ma等[28]利用液質(zhì)聯(lián)用技術,對蘋果梨(Pyrus pyrifolia cv.Pingguoli)的梨皮和果肉中的6個主要物質(zhì)進行了分析,結果表明,梨皮中的多酚類物質(zhì)比果肉中的要多,抗氧化性更強;通過HPLC-DAD進行檢測,對Rocha梨和其它品種梨中的多酚類物質(zhì)含量和抗氧化性進行了比較,經(jīng)過DPPH法和鐵還原能力測定,研究證實,Rocha梨含有最多的多酚類物質(zhì)和最強的抗氧化性[29]。

    3.2 三萜類和甾醇類物質(zhì)

    Cho等[30]對亞洲梨(Pyrus pyrifolia Nakai cv.Chuhwangbae)進行研究,從梨皮中提取并分離得到6種三萜類物質(zhì),通過ESI-MS和NMR技術進行結構鑒定,分別為(1)白樺酯醛,(2)羽扇豆醇,(3)白樺酯酸,(4)3-O-Z-咖啡酰白樺酯酸,(5)3-O-E-咖啡酰白樺酯酸,(6)3-O-E-咖啡酰齊墩果酸,其中首次發(fā)現(xiàn)(1),(4),(5),(6)等4種化合物。另外,化合物(4),(6)含有部分咖啡酸相似結構,具有更強的清除自由基能力,并對銅離子誘導氧化的鼠血漿有抑制效應。

    劉傳水等[31]采用硅膠柱層析,葡萄糖凝膠Pharmadex LH-20柱層析進行分離,通過MS和1D-NMR鑒定化合物結構。從棠梨花中分離得到了13種物質(zhì),分別鑒定為熊果醇,熊果醛,對羥基芐基甲基醚,對羥基芐基乙基醚,E-1-(4'-羥基苯基)-丁-1-烯-3-酮,5,6α-環(huán)氧-3β-醇-豆甾烷,5,6β-環(huán)氧-3β-醇-豆甾烷,豆甾-5-烯-3β,7α-二醇,棕櫚酸胡蘿卜苷,1,3-二亞油酸甘油酯,亞油酸,胡蘿卜苷,β-谷甾醇。

    3.3 黃酮類物質(zhì)

    Rychlińska和Gudej[32]報道了從西洋梨花中分離得到的5種黃酮苷,通過UV,NMR,MS等技術進行結構鑒定,分別為:山奈酚3-O-β-D-葡萄糖苷,異鼠李素3-O-β-D-葡萄糖苷,8-甲氧基山奈酚3-O-β-D-(2″-O-α-D-葡萄糖基)-葡萄糖苷,8-甲氧基山奈酚 3-O-β-D-(2″-O-α-L-鼠李糖基)-葡萄糖苷,異鼠李素3-O-β-D-(6″-O-α-L-鼠李糖基)-葡萄糖苷。

    3.4 多糖類物質(zhì)

    通過L9(33)正交試驗篩選杜梨(Pyrus betulaefolia Bge.)多糖最佳提取工藝,采用UV,IR,HPLC等方法對杜梨多糖(PBP)進行研究,探索PBP對羥自由基(·OH)、超氧陰離子自由基(O-·2)和1,1-二苯基-2-苦基肼(DPPH)自由基的清除活性。結果表明,在浸提劑用量為15 mL/g,提取溫度90℃,提取時間5 h的最優(yōu)條件下,PBP提取率達到18.65%。通過多角激光光散射儀分析,PBP分子質(zhì)量為392.9 kU。單糖組成分析表明,PBP是由阿拉伯糖、豐乳糖醛酸、鼠李糖、半乳糖和葡萄糖組成,其摩爾比為49.54∶28.68∶8.81∶8.45∶4.54[9]。

    3.5 揮發(fā)油物質(zhì)

    通過頂空萃取和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術分析3個白梨品種與3個砂梨品種商熟期果實香氣成分。分析得出,6個梨品種果實共同具有的主要香氣成分為:己醛、1-己醇、壬醛、乙酸己酯和2-戊基呋喃,其中己醛的質(zhì)量分數(shù)最高,為18.752 μg/g[33]。采用水蒸氣蒸餾法從杜梨果實中提取揮發(fā)油,通過氣相色譜-質(zhì)譜法對化學成分進行鑒定,其主要的化學成分為酯、烷、酸、酮及醇類化合物,其中質(zhì)量分數(shù)最多的為 n-棕櫚酸,占總揮發(fā)油的 9.74%[34]。

    4 生理活性

    隨著對梨屬植物天然活性物質(zhì)的深入研究,已發(fā)現(xiàn)其在抗氧化、抗炎、抑菌、抗腫瘤、保護神經(jīng)干細胞損傷等方面呈現(xiàn)出較強的活性。

    4.1 抗氧化作用

    Yasunori等[35]通過對乙醇誘導患有胃潰瘍的小鼠進行研究,探索西洋梨中原花青素對其病狀的效果。結果證明,梨中的原花青素對小鼠胃潰瘍病變的趨勢具有顯著的保護作用,并且認為其抗?jié)兊男Ч饕怯捎诰哂泻軓姷目寡趸?。楊江濤等?6]采用D-半乳糖所致衰老的小鼠為試驗對象,每天用不同劑量(100,200,400 mg/kg)的刺梨多糖對小鼠灌胃,47 d后觀察刺梨多糖對小鼠血漿、肝臟、腦組織中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、過氧化氫酶(CAT)含量的影響。實驗證明,刺梨多糖可以顯著提高小鼠血漿、肝臟和腦中的SOD及CAT含量,同時能夠防止脂膜的過氧化,并呈一定的量效關系,能提高衰老小鼠體內(nèi)抗氧化能力。趙小亮等[37]研究發(fā)現(xiàn),杜梨果實多糖對羥自由基(·OH)、超氧陰離子自由基)及DPPH自由基均有很好的清除作用,并呈現(xiàn)一定的量效關系。

    4.2 抗炎作用

    實驗發(fā)現(xiàn),白梨的提取物具有很好的抗炎效果,經(jīng)過抗炎活性實驗,β-谷甾醇、胡蘿卜苷、齊墩果酸、熊果酸呈現(xiàn)出較強的抗炎活性[5]。以角叉菜膠誘導患有水腫的大鼠足爪作為試驗對象,研究白梨提取物的抗炎和抗菌作用,結果表明,乙酸乙酯層提取物對由二甲苯誘導的耳朵水腫有較強的抑制作用,正丁醇層提取物次之[6]。

    4.3 抑菌作用

    研究發(fā)現(xiàn),白梨的提取物中分離得到的2β,19α-二羥基熊果酸,α-香樹脂素和槲皮素對于耳朵水腫具有良好的抑菌作用[6]。從蘋果梨表皮蠟中分離得到的正烷烴、三萜類物質(zhì)及脂肪酸也具有一定的抑菌效果[38]。通過生物方法的試驗發(fā)現(xiàn),從嫩梨枝(Pyrus spp.)中提取得到的苯醌對于梨火疫病菌發(fā)揮很強的抑菌活性[39]。

    4.4 抗腫瘤作用

    以H22(肝癌實體型)移植小鼠為研究對象,探索杜梨果實熱水提取物的抗腫瘤作用及對脾臟、胸腺指數(shù)的影響。實驗證明,杜梨果實熱水提取物對H22有顯著的抑制作用,使荷瘤小鼠的脾臟、胸腺指數(shù)明顯升高,具有一定的抗腫瘤活性[40]。

    4.5 神經(jīng)干細胞損傷的保護作用

    以大鼠胚胎紋狀體的神經(jīng)干細胞谷氨酸損傷模型為試驗對象,模擬神經(jīng)元的缺血缺氧性損傷,分別用谷氨酸損傷組和刺梨多糖(RRTP)不同濃度試驗組進行對照。結果證明,不同濃度的刺梨多糖(RRTP)對于神經(jīng)干細胞損傷有不同程度的減輕作用。高濃度RRTP試驗組神經(jīng)干細胞死亡率和乳酸脫氫酶漏出率較低,與谷氨酸損傷組比較有顯著性差異(P<0.01)。刺梨多糖對神經(jīng)干細胞損傷有明顯的保護作用[41]。

    5 展 望

    近年來,國內(nèi)外學者對于梨屬植物中天然活性物質(zhì)的探索研究越來越多,提取、分離純化及結構分析等方面的研究技術也在進行不斷地改進和發(fā)展。在提取方面,傳統(tǒng)的溶劑提取法耗時、成本高;超聲波、超高壓萃取技術具有提取率高、能耗低等優(yōu)點,正在得到廣泛應用。分離純化方面,高效液相色譜法具有分辨率高、分析速度快、定量分析準確度高等優(yōu)點,已經(jīng)在天然產(chǎn)物活性物質(zhì)的分離純化中得到了廣泛的應用。結構分析方面,UV,IR,MS,NMR對于活性物質(zhì)的結構解析起到關鍵性的作用。目前雖然對于梨屬植物天然活性成分的結構鑒定和分析已取得了一定的進展,但研究還不夠深入,尚有很多活性成分未被分離和鑒定。梨屬植物天然活性物質(zhì)的結構分析及其與生物功能活性之間的關系將成為今后研究的重點。

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