苜蓿多糖提取工藝及其生物活性研究進(jìn)展

余凡，楊恒拓，葛亞龍，王斌斌，田光輝

（陜西理工學(xué)院化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，陜西漢中723000）

苜蓿是一年生或多年生的草本、稀灌木，無草本氣味，適應(yīng)性強(qiáng)，可以在各種地形、土壤中生長，是世界上分布最廣泛、最古老的豆科栽培牧草，有“牧草之王”、“飼料之王”之稱。我國苜蓿的種植面積為 183hm2，居世界第五位［1］。

苜蓿多糖是從苜蓿中提取的一類多糖，被證明具有一定的生物活性［2］。苜蓿多糖和一些其他植物多糖一樣，在動(dòng)物研究中表現(xiàn)了很好的生理作用。苜蓿多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗病毒、降血糖、降血脂、抗氧化、抗衰老、抗輻射等作用，對(duì)機(jī)體的毒性很小。苜蓿多糖是一類很值得利用的綠色保健品和飼料添加劑，在藥用方面也表現(xiàn)出了廣闊的市場(chǎng)前景［2，3］。本文對(duì)苜蓿多糖的提取工藝、化學(xué)結(jié)構(gòu)、生理作用和應(yīng)用前景進(jìn)行了綜述。

1 苜蓿多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)

多糖是由單糖聚合而成，是由聚合度超過10的極大分子。由于多糖組分中單糖種類繁多，連接形式千差萬別，所以多糖化學(xué)結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，一般方法提取的多糖通常都是混合物［4，5］。多糖結(jié)構(gòu)的鑒定主要有兩種方法：化學(xué)分析法和物理分析法。化學(xué)分析法又包括酸水解、甲基化、過碘酸及其鹽的氧化、Smith降解、堿降解、酶水解免疫化學(xué)技術(shù)等方法。 物理分析方法包括 IR、MS、GC－MS、NMR等方法。根據(jù)不同的物質(zhì)中的多糖可以選擇不同的鑒定方法［6］。

苜蓿多糖是一種非淀粉多糖，淺黃色粉末，易溶于水，不溶于80%的乙醇水溶液，性質(zhì)穩(wěn)定。用茚三酮法檢驗(yàn)苜蓿多糖，其中不含蛋白質(zhì)、鞣酸和淀粉，為酸性多糖。經(jīng)三氯醋酸水解，薄層層析檢驗(yàn)，其中含葡糖糖、甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸和另一種未知的單糖，經(jīng)超濾波法檢驗(yàn)，苜蓿多糖分子量在 2 萬～6 萬［2］。

2 苜蓿多糖的提取

2.1 堿提取法

對(duì)于一些含有糠醛酸的多糖，用堿液提取比起用其他方法有更高的提取率。堿提法的原理是：植物細(xì)胞在堿液中會(huì)吸水溶脹以至于破裂，使細(xì)胞中的多糖釋放溶解在稀堿溶液中，使其提取率大大提高。常用的堿液有NaOH、Na2CO3、KOH、Ca（OH）2。 但有些多糖在堿性較強(qiáng)時(shí)會(huì)水解，為了防止多糖的降解，通常要通入N2或者加入硼氫化鈉或硼氫化鉀來保護(hù)多糖。堿提法對(duì)多糖提取率的影響主要有：堿的濃度、提取溫度、提取時(shí)間［7］。堿提法既節(jié)約時(shí)間，又減少了原材料和試劑的消耗，但堿液會(huì)與還原糖發(fā)生美拉德反應(yīng)［8］，將還原糖分解，使溶液的顏色加深，加重了后續(xù)的脫色工作。向東等［9］用堿提法提取南瓜中的多糖，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，通過堿提后，南瓜細(xì)胞變得疏松，細(xì)胞間排列變得松散，有的細(xì)胞壁甚至處于溶解狀態(tài)，這對(duì)南瓜多糖的提取有利。但堿提時(shí)發(fā)生了美拉德反應(yīng)，且堿液濃度越高顏色越深，還原糖的含量越低。趙晨淏等［10］用幾種不同的方法提取龍眼中的多糖并研究了不同方法提取的龍眼多糖的性質(zhì)，結(jié)果表明：堿提法的提取率較低，且堿提法提取的龍眼多糖DDPH·清除能力、氧自由基吸收能力和還原能力都較低，但采用堿提法得到的龍眼多糖粘度較高、半乳糖的含量高達(dá)42.15%，比其他方法得到的半乳糖高許多，所以對(duì)于含半乳糖較多的多糖，用堿提法可以有較高的提取率，但易降低提取的多糖的生物活性。

2.2 酸提取法

對(duì)于一些酸性多糖，更適合用酸提法提取。其原理和堿提法基本類似，方法是：在一定溫度下，用酸性介質(zhì)浸泡樣品一定時(shí)間后，再將溶液的pH調(diào)至中性，再加乙醇沉淀。但酸提法操作時(shí)應(yīng)嚴(yán)格控制其酸度，且在酸性介質(zhì)存在時(shí)，會(huì)引起多糖中的糖苷鍵的斷裂，破壞多糖的結(jié)構(gòu)，所以此方法很少用。趙晨淏等［10］用酸提法得到的龍眼多糖，粘度較大、半乳糖醛酸的含量較其他方法提取的含量都要高，但DDPH·清除能力較小。所以對(duì)于含有較多半乳糖醛酸的多糖可以考慮用酸提法。

2.3 水提取法

用水提取是一種比較傳統(tǒng)的方法，在一些植物多糖的提取中較為實(shí)用。具體方法是先將樣品用有機(jī)溶劑回流脫脂和脫除其中的色素，然后按一定的料液比加入熱水浸提一定時(shí)間，減壓真空抽濾，濾液濃縮，加入一定的乙醇沉淀，離心得到沉淀，用丙酮、乙醚、乙醇洗滌沉淀，低溫干燥便可得到多糖。此方法的原理是，植物細(xì)胞在熱水中軟化破裂，溢出多糖。優(yōu)點(diǎn)是：無需復(fù)雜的儀器設(shè)備，成本較低，操作簡單，基本不破壞多糖的結(jié)構(gòu)，且無污染。缺點(diǎn)是：需多次提取，耗費(fèi)時(shí)間。張東杰等［11］用水提法提取苜蓿中的多糖，以溫度、時(shí)間、浸提固液比、提取次數(shù)為單因素結(jié)合正交試驗(yàn)，得出提取的最佳工藝條件：浸提時(shí)間為1h，溫度為100℃，固液比為1∶40，浸提三次。在此工藝條件下，粗多糖提取率達(dá)6.80%，經(jīng)醇沉、5%的三氯乙酸正丁醇溶液及氯仿正丁醇溶液（5∶1）分離純化，可以得到脫蛋白多糖。蔡彬新等［12］用水提法提取海帶中的多糖，提取率達(dá)7.9%。

2.4 超聲波提取法

超聲波提取是利用超聲波高頻振蕩的空化作用、機(jī)械作用和熱力學(xué)作用。超聲波在振蕩時(shí)的空化作用會(huì)產(chǎn)生空化泡，空化泡在振蕩中不斷運(yùn)動(dòng)漲大并破裂，在破裂時(shí)吸收聲場(chǎng)的能量在極短的時(shí)間和極小的空間內(nèi)釋放，產(chǎn)生高溫高壓的環(huán)境，同時(shí)產(chǎn)生激波，使細(xì)胞壁破裂，釋放出內(nèi)含物，直接進(jìn)入溶劑中混合。另外超聲波在運(yùn)行過程能對(duì)溶劑進(jìn)行加熱，從而促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)有效成分的溶解。超聲波提取的具體方法是：將樣品加入一定的溶劑后放入超聲波中浸提一定時(shí)間，然后過濾，濃縮，加入一定的乙醇沉淀。超聲波的處理溫度低，與傳統(tǒng)的水提法比較，時(shí)間較短，提取率較高。不足之處是：超時(shí)間的振蕩可能導(dǎo)致大分子多糖斷裂，影響其生物活性。呂明生等［13］用超聲波提取雪蓮薯中的多糖，結(jié)果表明，提取率可高達(dá)53.3%。陳紅等［14］用超聲波提取水溶性大豆中的多糖，提取率達(dá)8.82%，經(jīng)Sevag去蛋白純化多糖回收率為 60.30%。

2.5 微波提取法

微波是頻率介于300MHz到300 GHz之間的高頻電磁波，它具有強(qiáng)大的穿透力，能夠透過細(xì)胞壁到達(dá)細(xì)胞的內(nèi)部，使細(xì)胞內(nèi)部產(chǎn)生高溫高壓，當(dāng)壓力超過細(xì)胞所能承受的壓力后，細(xì)胞就會(huì)自動(dòng)破裂，細(xì)胞內(nèi)的有效成分就會(huì)釋放出來，進(jìn)入周圍的溶劑中。此法可以明顯地縮短反應(yīng)時(shí)間，提取效率高，操作簡單，在一些植物多糖的提取中被廣為使用。劉小麗等［15］用微波法提取香菇中的多糖，最佳提取時(shí)間僅需5 min，提取率可達(dá)9.46%，用離子交換樹脂去蛋白后純度可達(dá)85%。蔣文明等［16］用微波輔助堿液提取仙草中的多糖，最佳提取時(shí)間僅需90 s，提取率能達(dá)43.84%。所以微波提取可大大節(jié)約提取時(shí)間。

2.6 酶解提取法

酶在較溫和的條件下可以將植物細(xì)胞分解，使細(xì)胞內(nèi)的有效成分釋放出來。同時(shí)利用酶的高選擇性，可以降低細(xì)胞壁、蛋白質(zhì)等對(duì)細(xì)胞內(nèi)多糖的阻礙，獲得較高的提取率。此外用蛋白酶可以除去細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)，以便得到較純的多糖。具體方法是：在溫水中加入一定量的生物酶，在合適的pH下，加入一定的樣品浸提一定的時(shí)間，再過濾，濃縮，最后加入一定量的乙醇沉淀即可得到相對(duì)較純的多糖。石勇等［17］用復(fù)合酶法提取紅棗中的多糖，提取率達(dá) 4.61%，高于水提法的 2.69%，可以看出復(fù)合酶法較水提法有很大的優(yōu)勢(shì)。

2.7 超濾提取法

超濾提取法是利用超濾膜分離得到植物多糖。由于超濾膜特殊的不對(duì)稱微孔結(jié)構(gòu)，在一定壓力下，可以使水等溶劑通過，而多糖、膠體、蛋白質(zhì)等大分子不能通過。用超濾膜分離得到的多糖，不會(huì)破壞其生物活性，產(chǎn)率高，無污染，耗能低，設(shè)備簡單。張雪婷［18］用超濾法和醇提法兩種方法提取苜蓿中的多糖，結(jié)果表明：超濾法的多糖平均得率明顯高于醇提法的多糖得率。

2.8 超臨界萃取法

超臨界萃取是以超臨界流體為溶劑，從樣品中萃取某種成分的技術(shù)。超臨界流體既具有氣體的高擴(kuò)散性，又具有液體的高溶解性。目前超臨界CO2流體在天然產(chǎn)物的提取分離中已廣泛運(yùn)用。超臨界CO2流體具有極好的溶解性、效率高、無污染、安全可靠等優(yōu)點(diǎn)，在天然產(chǎn)物的提取中有很好的應(yīng)用前景。張素霞［19］用超臨界CO2提取香菇中的多糖，與傳統(tǒng)的水提法相比，多糖的提取率高了3.16%，且產(chǎn)品的色澤、風(fēng)味更加接近標(biāo)準(zhǔn)品。

比較以上幾種方法可知：多糖的提取最節(jié)省時(shí)間且有較高提取率的是微波提取法；對(duì)于含半乳糖較多的多糖，用堿提法較好，因?yàn)閴A提法對(duì)半乳糖可以有較高的提取率；對(duì)于含有較多半乳糖醛酸的多糖，用酸提法較好；但要對(duì)提取的多糖做定性試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)盡量避免用堿提法和酸提法，以免較大程度地降低多糖的生物活性，可以考慮用超濾法或超臨界萃取法，盡可能多地保持多糖的生物活性。酶解提取法可以得到相對(duì)較純的多糖。

3 苜蓿多糖的生理作用

3.1 免疫調(diào)節(jié)作用

苜蓿多糖是具有生物活性的植物多糖，能增強(qiáng)動(dòng)物的免疫功能，具有抗感染、抗腫瘤、降血脂、抗輻射等藥理活性。它能促進(jìn)單核細(xì)胞的增殖，激活和增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的免疫功能，促進(jìn)多種細(xì)胞免疫因子的分泌，增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞的功能和殺傷細(xì)胞的活性［2］。

張軍等［20］用苜蓿多糖作為免疫增強(qiáng)劑，進(jìn)行了苜蓿多糖強(qiáng)化豬瘟兔化弱毒疫苗實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明：苜蓿多糖作為免疫增強(qiáng)劑，能使豬的外周血液中B淋巴細(xì)胞數(shù)量明顯增多，血清IgG水平提高。江振瑩等［21］報(bào)道，在肉仔雞早期生長階段添加水溶性多糖能促進(jìn)巨嗜細(xì)胞吞噬能力和T細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力，對(duì)體液免疫應(yīng)答能力和生產(chǎn)性能無顯著的影響。

3.2 抗腫瘤作用

多糖具有抗腫瘤作用，可被用作抗腫瘤及輔助藥物開發(fā)。研究表明，香菇多糖具有很好的抗腫瘤作用。苜蓿多糖本身尤其是經(jīng)異構(gòu)化或修飾后，具有很好的抗腫瘤作用［2］。 張東杰等［22］用水提—醇沉法得到苜蓿粗多糖，經(jīng)DEAE－Cellulose離子交換層析，用NH4HCO3溶液分段洗脫后得S1、S2、S3和S4四種組分，將這四種組分和粗多糖S0分別通過腹腔注射于移植S－180腹水瘤和H－22腹水瘤的小鼠，結(jié)果表明，S1、S2能明顯抑制S－180腹水瘤和H－22腹水瘤小鼠體重的增加，不同組分的多糖與對(duì)照組相比均能延長荷瘤小鼠的生存期，且S1、S2表現(xiàn)得極明顯，說明苜蓿多糖能輔助治療腫瘤。

3.3 抗病毒作用

多糖作為生物免疫活性調(diào)節(jié)物質(zhì)，還具有抗病毒作用，被用作抗病毒藥物開發(fā)。含磺酸基的海藻類多糖和硫酸酯化勻多糖如卡拉膠、右旋糖等抗病毒效果良好［23］。它的抗病毒的作用機(jī)制可能是增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，抑制感染細(xì)胞的復(fù)制，競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合病毒與細(xì)胞的結(jié)合位點(diǎn)。張麗萍等［24］使用水提—醇沉法從苜蓿中提取粗多糖，經(jīng)DEAECellulose離子交換層析，用NH4HCO3溶液分段洗脫后得 S1、S2、S3和 S4四種組分，將其配置成一定濃度的多糖溶液，采用試劑盒對(duì)體外HIV逆轉(zhuǎn)錄酶和蛋白酶活性的抑制作用進(jìn)行檢測(cè)比較，結(jié)果表明：S3、S4對(duì)HIV逆轉(zhuǎn)錄酶活性抑制率很明顯，分別為 99.6%、76.7%，S1、S2 相比而言較弱；但S1、S2對(duì)蛋白酶活性抑制率較明顯，分別為58.6%、55.9%，S3、S4則較弱。 實(shí)驗(yàn)表明，苜蓿多糖抗 HIV的作用機(jī)制可能是抑制逆轉(zhuǎn)錄酶及蛋白酶活性，且具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

3.4 其他作用

植物多糖作為生物免疫活性物質(zhì)，還有許多作用，如降血脂、降血糖、抗氧化、抗衰老等作用。如茶多糖具有降血糖、降血脂的作用［25］，魔芋多糖具有降血糖、降血脂的作用，靈芝多糖具有降血脂的作用［26］，地黃多糖具有抗衰老的作用［27］，大豆多糖具有抗氧化性［25］。國內(nèi)外對(duì)苜蓿多糖在這方面的作用的報(bào)道還很少，有待學(xué)者進(jìn)一步探究。

4 展望

目前我國對(duì)苜蓿多糖的利用僅是粗產(chǎn)品，對(duì)其研究僅限于實(shí)驗(yàn)室，還沒達(dá)到商業(yè)化。國內(nèi)外對(duì)苜蓿多糖結(jié)構(gòu)的研究報(bào)道還很少。苜蓿多糖對(duì)人和動(dòng)物的影響和作用機(jī)理還有待進(jìn)一步探究。

雖然苜蓿多糖的研究還存在一些技術(shù)不成熟的問題，但其應(yīng)用前景很廣闊。首先對(duì)苜蓿多糖的生理作用的研究還不是很深入，許多未發(fā)現(xiàn)的藥用價(jià)值都還需進(jìn)一步研究。其次，苜蓿多糖的免疫增強(qiáng)效益和抑制HIV逆轉(zhuǎn)錄酶和蛋白酶活性的作用，展現(xiàn)了其獨(dú)特的功效，可以從單純的動(dòng)物試驗(yàn)向開發(fā)人的營養(yǎng)保健品、醫(yī)療用品方向發(fā)展，這些都指明了其廣闊的應(yīng)用前景。再者，國際上對(duì)糖類的研究日新月異，內(nèi)容包括糖生物學(xué)、糖工程學(xué)等，目前日本，美國，歐盟十分重視糖類的研究，都相繼啟動(dòng)了研究平臺(tái)?？傊?，苜蓿多糖作為一種天然植物多糖，其研究會(huì)有很大的價(jià)值，加之苜蓿的廉價(jià)、資源充足，苜蓿多糖的開發(fā)利用具有很廣闊的前景。

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