DNA條形碼技術(shù)在常見(jiàn)水生動(dòng)物分類中的應(yīng)用

吳清楠

(暨南大學(xué) 廣東廣州 510632)

DNA條形碼是指生物體內(nèi)一段具有足夠變異的標(biāo)準(zhǔn)化短DNA片段,這段保守的DNA片段在不同物種之間具有特異性,能夠很好地代表不同物種,因此在分類學(xué)和鑒定學(xué)方面起著重要的作用。DNA條形碼技術(shù)是使用DNA條形碼來(lái)進(jìn)行快速的物種鑒別和分類的一種技術(shù),普遍方法是對(duì)待測(cè)物種680bp長(zhǎng)的線粒體細(xì)胞色素C氧化酶亞單位Ⅰ(Cytochrome C oxidase subunit,COⅠ)基因進(jìn)行測(cè)序,采用Kimura-2-Parameter模型分析物種之間的遺傳距離構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),并與DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)中該物種及其近似種序列進(jìn)行對(duì)比,根據(jù)相互間的遺傳距離或相似度最終對(duì)檢測(cè)物種進(jìn)行鑒定[1]。

自從DNA條形碼技術(shù)的概念被提出并隨即推出“生命條形碼”項(xiàng)目后,這項(xiàng)簡(jiǎn)單而實(shí)用的技術(shù)引起了分類學(xué)家、生態(tài)學(xué)家、生物學(xué)家、農(nóng)學(xué)家、植物學(xué)家等的高度重視[2],人們采用DNA條形碼技術(shù)發(fā)現(xiàn)了更多的新物種和隱存種、提高了物種分類的分辨率,同時(shí)也指出并糾正了以往分類中所存在的錯(cuò)誤,運(yùn)用新生的DNA條碼技術(shù)再結(jié)合傳統(tǒng)的分類學(xué)審查能夠揭示更加豐富的生物多樣性,為研究生物進(jìn)化過(guò)程提供了新的思路[3]。

1 DNA條形碼在魚(yú)類方面的應(yīng)用

魚(yú)類在水生生態(tài)系統(tǒng)扮演著一個(gè)很重要的角色,然而對(duì)魚(yú)類進(jìn)行準(zhǔn)確辨別存在一定的難度,特別是在生物多樣性很高的熱帶地區(qū),僅僅光靠外部形態(tài)特征很難區(qū)分魚(yú)的具體品種。為了解決這個(gè)難題,Nwani等[4]將來(lái)自尼日利亞?wèn)|南部的363個(gè)魚(yú)類樣本的DNA提取出來(lái),PCR擴(kuò)增后對(duì)標(biāo)準(zhǔn)條形碼序列進(jìn)行測(cè)序,由于生物條形碼數(shù)據(jù)系統(tǒng)中包含了幾乎所有物種的標(biāo)本數(shù)據(jù)以及相關(guān)序列信息,最后通過(guò)系統(tǒng)所提供的分析工具估算出種間的平均遺傳距離差異60倍高于種內(nèi)的平均遺傳距離,種內(nèi)樣本平均遺傳距離差異是0.17%而同間則達(dá)到10.29%,很好的區(qū)分了那些表面看上去很相似但是遺傳距離卻相差60倍的魚(yú)類。在亞洲地區(qū),Zhang等人[5]研究了158種來(lái)自日本海洋的229個(gè)魚(yú)類COⅠ基因樣本,實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明種間的平均遺傳距離將近60倍高于種內(nèi)的平均遺傳距離,并且兩個(gè)物種的雜交現(xiàn)象也可以通過(guò)在壽命數(shù)據(jù)系統(tǒng)(BOLD)里搜索條碼來(lái)檢測(cè),說(shuō)明了DNA條形碼技術(shù)的確提供了一種新的魚(yú)類鑒定方法。Wang等人[6]計(jì)算出來(lái)自中國(guó)南海重要漁區(qū)的樣本同系平均遺傳距離差異為17.260%,同屬之間為20.097%,而同種內(nèi)個(gè)體之間只有0.317%,但他特別指出條形碼技術(shù)識(shí)別的確具有一定的可靠性和可用性,但由于一些密切近源種可能會(huì)有漸滲雜交,因此為了得到更加精確的分類結(jié)果,即使運(yùn)用了條形碼技術(shù)也還需要進(jìn)行分類學(xué)上的審查。此外DNA條形碼技術(shù)為人們提供了更加高效的工具來(lái)研究那些仍舊不為人知的隱性種,Zemlak等[7]研究了印度洋沿岸35種魚(yú)的229個(gè)COⅠ基因樣本,發(fā)現(xiàn)南非和澳大利亞海域的同種魚(yú)類的差異很大,說(shuō)明了有大量的隱存魚(yú)種存在。

在市場(chǎng)方面,魚(yú)類是人類食物主要的蛋白質(zhì)來(lái)源之一,因此魚(yú)類市場(chǎng)的發(fā)展日益迅猛,然而在全球市場(chǎng)中魚(yú)類貼錯(cuò)標(biāo)簽現(xiàn)象成為一個(gè)越來(lái)越嚴(yán)重的問(wèn)題。在南非,Cawthorn等[8]測(cè)定了南非海鮮批發(fā)商和零售店的248種魚(yú)類的COⅠ基因序列,95%的樣本都可以被準(zhǔn)確鑒別,但反映出來(lái)自批發(fā)商的9%樣本以及來(lái)自零售商的31%樣本標(biāo)簽上寫(xiě)明的種與其真正屬于的種并不一致。同年在美國(guó)華盛頓州,Cline等[9]對(duì)整個(gè)華盛頓州西部的商店和餐館的鮭魚(yú)也進(jìn)行COⅠ基因測(cè)序,數(shù)據(jù)表明在99個(gè)樣本中有11%是把大西洋鮭魚(yú)當(dāng)做太平洋鮭魚(yú)來(lái)賣(mài),超過(guò)38%的餐館會(huì)混淆魚(yú)的品種。魚(yú)類品種混淆的原因有一部分是無(wú)意識(shí)或者了解程度不夠的失誤,但不可否認(rèn)的是也有一部分是販賣(mài)商為了增加利潤(rùn)而刻意用價(jià)格低廉的相似海鮮種類代替昂貴或者需求高的種類,損害了消費(fèi)者的利益破壞市場(chǎng)的貿(mào)易平衡,因此DNA條形碼技術(shù)推廣使用可以大大提高國(guó)內(nèi)外魚(yú)類等海鮮市場(chǎng)的交易透明度,促進(jìn)市場(chǎng)經(jīng)濟(jì)的正常發(fā)展。

2 DNA條形碼在軟體動(dòng)物方面的應(yīng)用

鞘亞綱(Coleoidea)是頭足綱(Cephalopoda)下的一類軟體動(dòng)物,在海洋生態(tài)系統(tǒng)占據(jù)重要位置也具有很高的商業(yè)價(jià)值,但是一些鞘亞綱物種很難根據(jù)傳統(tǒng)的形態(tài)特點(diǎn)來(lái)進(jìn)行區(qū)分,不僅是由于關(guān)系密切的種群之間的形態(tài)差異很細(xì)微,還要考慮到在標(biāo)本捕捉的過(guò)程中可能會(huì)損壞某些特征形態(tài)增加了鑒別的難度。Dai等認(rèn)為DNA條形型碼技術(shù)在識(shí)別鞘亞綱方面有著很大的潛力,他們使用了兩個(gè)線粒體片段COI基因以及核糖體大亞基16SrRNA,對(duì)種內(nèi)和種間的遺傳距離進(jìn)行了評(píng)估,并用鄰接樹(shù)(Neighbour-joining tree)和貝葉斯樹(shù)分析(Bayesian analyses)鑒定了了來(lái)自中國(guó)大約三分之一的34種鞘亞綱樣本之間的關(guān)系,這項(xiàng)研究不僅發(fā)現(xiàn)了神秘的鞘亞綱的多樣性,而且還新穎的使用了兩個(gè)線粒體基因來(lái)研究進(jìn)化關(guān)系為其他生物學(xué)研究奠定了新的基礎(chǔ)[10]。同屬于頭足綱的蛸科(Octop odidae)中物種間親緣關(guān)系現(xiàn)今仍然了解得很貧乏,DNA條形碼技術(shù)推出后,Kaneko[11]使用COI和COIII的基因序列調(diào)查了日本鄰近海域的淺水章魚(yú)間的親緣關(guān)系,并與借助形態(tài)學(xué)分類得出的鑒定結(jié)果進(jìn)行比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果所獲得的來(lái)自7個(gè)屬34個(gè)種的45個(gè)樣本的COⅠ(657bp)和COⅢ(464bp)序列作為參照樣本被保存在東京國(guó)家自然科學(xué)博物館,這一結(jié)果這為將來(lái)的章魚(yú)鑒定提供了一個(gè)初步的參考數(shù)據(jù)庫(kù)。同樣,Sun[12]等人的研究中收集了來(lái)自中國(guó)沿海的45種新進(jìn)腹足超目(Caenogastropoda)的110份COⅠ基因樣品,在研究中鄰接樹(shù)和貝葉斯樹(shù)的數(shù)據(jù)為DNA條形碼技術(shù)準(zhǔn)確區(qū)分物種提供了有效的證據(jù)。

軟體動(dòng)物中還有經(jīng)常見(jiàn)到的雙殼綱(Bivalvia),為了對(duì)扇貝科(Pectinidae)有進(jìn)一步的了解,Feng等[13]測(cè)定了8種63例扇貝的線粒體COⅠ基因和16SrRNA基因的部分序列,表明DNA條形碼技術(shù)同樣可以分析出種間的遺傳差異水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于同一種內(nèi)的遺傳差異水平從而對(duì)這些扇貝進(jìn)行分類,并且識(shí)別的結(jié)果和以殼微觀結(jié)構(gòu)和形態(tài)特征為主的沃勒分類結(jié)果一致。馬蛤蜊科(Mactridae)的物種由于身體柔軟而具有很高的可塑性,因此在形態(tài)上難以區(qū)分,Ni等[14]認(rèn)為DNA條形碼技術(shù)可以為這個(gè)難題提供有效的解決措施,實(shí)驗(yàn)中對(duì)36個(gè)樣本的COⅠ基因和16SrRNA基因的部分序列進(jìn)行測(cè)序,結(jié)果表明在COI基因中有著明顯的遺傳差異,但是在16SrRNA卻沒(méi)有。盡管如此但鄰接樹(shù)和貝葉斯樹(shù)仍舊指出的除了一個(gè)樣本以外其他所有樣本都屬于同一物種下的單系分支,同時(shí)序列變異現(xiàn)象和貝葉斯的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)也揭示著潛在隱性種的存在。

3 DNA條形碼在甲殼類動(dòng)物方面的應(yīng)用

海洋甲殼類動(dòng)物由于高度的形態(tài)多樣性通常都很難利用傳統(tǒng)方法進(jìn)行識(shí)別,不少研究嘗試運(yùn)用DNA條形碼技術(shù)去探索甲殼類物種之間的分界線。為了擴(kuò)充DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù),Radulovici等[15]研究來(lái)自圣勞倫斯灣河口的軟甲綱樣本,在95%的情況下樣本檢測(cè)出的基因序列與已知的一致,還發(fā)現(xiàn)了四個(gè)物種的種內(nèi)差異高達(dá)3.78%～13.6%,這說(shuō)明了存在隱存種,實(shí)驗(yàn)證明了DNA條形碼技術(shù)對(duì)許多后生動(dòng)物群體包括甲殼類動(dòng)物的鑒定十分有效。長(zhǎng)臂蝦科種內(nèi)和種間形態(tài)變異很保守,而Robe等[16]運(yùn)用條形碼技術(shù)去識(shí)別長(zhǎng)臂蝦科的種內(nèi)和種間的差異,盡管只能夠區(qū)分95%的情況,但是和以往落后的分類學(xué)技術(shù)相比,條形碼技術(shù)很有可能幫助人類發(fā)現(xiàn)以前所忽略的分類和進(jìn)化問(wèn)題。

在智利,甲殼類動(dòng)物如短尾蟹是一項(xiàng)利用極其廣泛的海洋資源,在大量投入蟹肉制品生產(chǎn)的過(guò)程中就出現(xiàn)了難以鑒定蟹品種的技術(shù)問(wèn)題,這成為阻礙蟹肉制品產(chǎn)業(yè)發(fā)展的一大障礙。在Haye等[17]的研究中嘗試將DNA條形碼技術(shù)投入商業(yè)之中,對(duì)七種商業(yè)化蟹肉進(jìn)行身份驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)了市場(chǎng)上許多黃道蟹被誤認(rèn)為是短尾蟹,造成市場(chǎng)運(yùn)營(yíng)的混亂。研究最后表明以標(biāo)準(zhǔn)DNA條形碼技術(shù)和系統(tǒng)發(fā)育分析為基礎(chǔ)的程序可做為蟹肉加工產(chǎn)品的檢查工具投入到市場(chǎng)管理模式中。

4 DNA條形碼在底棲動(dòng)物方面的應(yīng)用

在2009年美國(guó)密歇根州舉行的北美底棲生物學(xué)協(xié)會(huì)年度會(huì)議中提到了DNA條形碼技術(shù)對(duì)底棲生物研究的貢獻(xiàn),該技術(shù)是目前速度最快準(zhǔn)確度最高的分類鑒定技術(shù)。在DeWalt等[18]的研究中闡述了DNA條形碼技術(shù)主要是通過(guò)將序列匹配到序列庫(kù)以幫助鑒定樣本。雖然該技術(shù)在一些其他方面應(yīng)用的越來(lái)越頻繁,但針對(duì)底棲生物科學(xué)這一新興領(lǐng)域的研究資料卻相對(duì)較少,因此研究力圖通過(guò)分類學(xué)家和條形碼技術(shù)倡導(dǎo)者做出分類和大量的底棲生物樣本序列,建立一個(gè)可供底棲生物科學(xué)家使用的條形碼數(shù)據(jù)庫(kù),也將便利的DNA條形碼技術(shù)擴(kuò)展底棲生物的應(yīng)用之中,隨著先進(jìn)采樣制度的不斷發(fā)展,相信在不久的將來(lái)便可實(shí)現(xiàn)。

5 討論與展望

DNA條形碼技術(shù)提供了一個(gè)快速而簡(jiǎn)單的物種鑒定手段,它具有不受發(fā)育階段、個(gè)體形態(tài)特征和不同物種的限制,一次可以鑒定大量樣本并且保證高精確性的優(yōu)點(diǎn)[19]。從學(xué)術(shù)方面而言,DNA條形碼技術(shù)在一些物種鑒定的過(guò)程中又會(huì)發(fā)現(xiàn)隱存物種,提高了物種的多樣性,推動(dòng)了物種分類學(xué)和進(jìn)化學(xué)的快速發(fā)展;從市場(chǎng)方面而言,由于國(guó)際上越來(lái)越重視海鮮市場(chǎng)物種的精確鑒定,運(yùn)用DNA條形碼技術(shù)可以減少產(chǎn)品的混淆失誤,加大了檢查力度減少了為謀取利潤(rùn)而有意貼錯(cuò)標(biāo)簽的行為,使得市場(chǎng)貿(mào)易更加公平和規(guī)范。盡管DNA條形碼技術(shù)鑒定的成功率不能完全達(dá)到100%,這其中存在樣本本身DNA條形碼難以識(shí)別的原因,也存在人為過(guò)失,但是和以往繁雜的分類手段相比已經(jīng)大大提高了鑒定效率?？偠灾?在信息網(wǎng)絡(luò)技術(shù)和生物信息學(xué)飛速發(fā)展的時(shí)代,可信息化的DNA條形碼技術(shù)具有著極大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

[1]李新光,王璐,趙峰,馬麗萍,孫永,周德慶.DNA條形碼技術(shù)在魚(yú)肉及其制品鑒別中的應(yīng)用[J].食品科學(xué),2012.

[2]Jinbo U., Kato T., Ito M. Current progress in DNA barcoding and future implications for entomology.Entomological Science.2011,14:107-124.

[3]康曉龍,馮登偵.DNA條形碼及其在動(dòng)物遺傳多樣性中的應(yīng)用[J].畜牧與獸醫(yī)生,2012,06:94-07.

[4]Nwani, C.D., et al. DNA barcoding discriminates freshwater fishes from southeastern Nigeria and provides river systemlevel phylogeographic resolution within some species.Mitochondrial DNA.2011,22:43-51.

[5]Zhang J.B. and Hanner R.DNA barcoding is a useful tool for the identification of marine fishes from Japan.Biochemical Systematics and Ecology.2011,39:31-42.

[6]Wang Z.D.,et al.DNA barcoding South China Sea fishes Mitochondrial DNA.2012,23:405-410.

[7]Zemlak T.S.,et al.DNA barcoding reveals overlooked marine fishes.Molecular Ecology Resources.2009,09:237-242.

[8]Cawthorn D.M.,Steinman H.A.,Witthuhn R.C. DNA barcoding reveals a high incidence of fish species misrepresentation and substitution on the South African market.Food Research International.2012,46:30-40.

[9]Cline E.,et al. Marketplace substitution of Atlantic salmon for Pacific salmon in Washington State detected by DNA barcoding.Food Research International.2012,45:388-393.

[10]Dai L.N., et al.,DNA barcoding analysis of Coleoidea (Mollusca:Cephalopoda) from Chinese waters. Molecular Ecology Resources.2012,12:437-447.

[11]Kaneko N.,Kubodera T., and A. Iguchi, Taxonmic study shallow-water Octopuses (cephalopoda:octopodidae)in japan and adjacent waters using mitochondrial genes with perspectives on octopus DNA barcoding. Malacologia.2011,54:97-108.

[12]Sun Y., et al.DNA barcoding of Caenogastropoda along coast of China based on the COI gene.Molecular Ecology Resources.2012,12:209-218.

[13]Feng Y.W., et al.DNA barcoding and phylogenetic analysis of Pectinidae (Mollusca: Bivalvia) based on mitochondrial COI and 16S rRNA genes. Molecular Biology Reports. 2011,38:291-299.

[14]Ni L.H., et al.DNA barcoding and phylogeny in the family Mactridae (Bivalvia: Heterodonta): Evidence for cryptic species.Biochemical Systematics and Ecology.2012. 44:164-172.

[15]Radulovici A.E.,Sainte-Marie B.,Dufresne F.DNA barcoding of marine crustaceans from the Estuary and Gulf of St Lawrence: a regional-scale approach. Molecular Ecology Resources.2009,9:181-187.

[16]Robe L.J.,Machado S.,Bartholomei-Santos M.L.The DNA Barcoding and the Caveats with Respect to Its Application to Some Species of Palaemonidae (Crustacea, Decapoda). Zoological Science.2012,29:714-724.

[17]Haye P.A., et al.Authentication of commercialized crabmeat in Chile using DNA Barcoding. Food Control.2012,25:239-244.

[18]DeWalt R.E.et al. DNA barcoding: a taxonomic point of view.Journal of the North American Benthological Society.2011,30:174-181.

[19]韋健紅,吳文如,喻良文,林小樺,李薇. DNA條形碼技術(shù)在生物分類中的應(yīng)用[J].廣東藥學(xué)院學(xué),2010,26:430-433.