共價結(jié)合法固定化酶活性載體的研究進展

郎偉超 張麗

(南京理工大學環(huán)境與生物工程學院 江蘇南京 210094)

酶的共價結(jié)合固定化是通過共價鍵把酶連接到帶有惰性基團或者活性基團的載體上。共價結(jié)合法已經(jīng)成為酶固定化的最主要的方法之一。其原理非常簡單,用預先設計好的,帶有活性基團的不溶性載體,在適宜的條件下與氨基酸發(fā)生反應,形成共價鍵。

20世紀60年代,研究發(fā)現(xiàn),預先制備好的載體不僅僅是作為支撐酶的骨架,還可以使酶的性質(zhì)(如穩(wěn)定性、活力和選擇性)發(fā)生改變。

1 活性載體的合成

活性載體是指具有活性基團,在適當條件下,能直接與酶結(jié)合的聚合物。因此,聚合物中應該至少有一種單體含有活性基團,該基團可以與酶中氨基酸殘基發(fā)生反應。

1.1 含酰基疊氮的聚合物

含?；B氮的聚合物可以通過化學修飾直接制備得到。聚丙烯酰胺(PAAm)或者其他帶有酰肼基團的聚丙烯酸都可以活化,使其連接活性?；B氮來結(jié)合酶。

2010年孔黎春、胡潔玲等人[1]在氟甲磺酸鋅的催化下合成?；B氮化合物。在三氟甲磺酸鋅催化下,由?；讲⑷蚺c疊氮化鈉,發(fā)生酰化反應。該方法的原料易制備保存、反應速度快、產(chǎn)率高、產(chǎn)物分離簡單。

但是,酰基疊氮可以同很多氨基酸殘基發(fā)生反應,使酶可以通過不同的連接方式固定,而且固定化后酶活力較差。因此,這類聚合物很少被用于酶的固定化。

1.2 含酸酐的聚合物

含有酸酐基團的聚合物是第二種被用于共價固定化的化合物?？梢酝ㄟ^帶有酸酐(檸檬酸酐、甲基丙烯酸酐、馬來酸酐)的單體在一定條件下直接聚合成共聚物或者均聚物。這種方法可以通過改變單體或者交聯(lián)劑來構(gòu)建具有不同結(jié)構(gòu)的載體,而且可以調(diào)節(jié)載體的疏水性能。

2010年,鄭建國、張松平等[2]用靜電紡絲法制備聚乙烯馬來酸酐共聚物納米材料。在聚合物濃度0.35g/mL,針尖到接收板距離為25cm,電紡液流量250μL/h,電壓12kV條件下,獲得了直徑300nm且分布均勻的納米材料。

但是帶有酸酐基團的聚合物所帶的電荷會導致酶的水解反應和疏水反應;載體所帶有的羧基會使固定化酶的最適作用pH增加1-2.5個單位。此外,對于顆粒狀的載體,其表面積較小。

1.3 帶有鹵素原子的聚合物

1970年,Brown進行了鹵素置換反應。發(fā)現(xiàn)酶不僅可以在緩沖液中進行固定,還可以在含水量低的有機溶液中固定。

2002年,Bahar等人[3]用無孔的聚對甲基苯乙烯(PCMS)通過PEI與載體連接,制備能承載0.019轉(zhuǎn)化酶的載體。其內(nèi)部擴散阻力很小,可忽略不計,而且固定化酶的熱穩(wěn)定性是游離酶的5倍。

1.4 聚碳酸酯

自20世紀70年代開始,聚碳酸酯就已經(jīng)被用于固定化酶。但是在此后的20年里,機會沒有這類聚合物被用于固定化酶的報道。

黃家賢等人[4]以乙烯撐碳酸酯為聚合單體,以親水性N,N’-亞甲基爽烯酰胺為交聯(lián)劑,分別用N-乙烯基吡咯烷酮和丙烯酸-β-羥已酯兩種親水性單體作為酶載體的成分,通過反相懸浮聚合,合成了兩種性能較好的載體,它們夠快速與酶反應,并且酶活力良好。

Ding LH等人發(fā)現(xiàn),聚碳酸酯是可溶性的均聚物,通過交聯(lián)可以得到不溶性的球狀載體,可以用于固定胰蛋白酶。酶的固定量達到0.25。但是,酶的活力回收率卻低于15%。原因可能是反應基團的密度升高或者是擴散阻力增大而導致酶的活力下降。濕載體的最大固定化量為0.025。

1.5 帶有乙?；木酆衔?/h3>

Slotmkowski通過含乙酰基的單體聚合制備了醛基聚合物載體,該載體包含由丙烯醛合成的聚丙烯醛,聚丙烯醛是可溶于水的4-乙烯基嘧啶與丙烯醛的共聚物,該載體被用于乙醇脫氫酶和NADH的固定化。

目前,使用帶乙?；木酆陷d體固定化酶的方法正漸漸失去重要性,這不僅僅是因為Schiff堿連接的不穩(wěn)定性,更是因為含醛基的聚合物更容易通過基團互變技術(shù)得到。

1.6 苯酚聚合物

苯酚聚合物通常具有成本低、親水性、易于制備等特點。較為常用的是鄰苯二酚或者對苯二酚與戊二醛或者甲醛縮合反應。這類多空載體可以用于多種酶的固定化,例如:磷酸酯酶、卵清蛋白。

2 展望

載體在酶固定化技術(shù)中占有舉足輕重的地位,具有優(yōu)良的性能的載體能夠?qū)Υ蠓岣呙腹潭ɑЧ?因此,在固定化酶的過程中選擇制備合適的的載體是非常重要的。近年來,隨著化學、材料等技術(shù)的發(fā)展,固定化技術(shù)也得到了迅速發(fā)展,特別是共價結(jié)合的載體材料研究也取得了很大進展,并且有向精細化發(fā)展的趨勢。因此,在對傳統(tǒng)載體材料改進的同時,開發(fā)新型改性復合載體將成為今后研究的重點。

[1]孔黎春,胡潔玲,張龍峰.三氟甲磺酸鋅催化下?；B氮化合物的合成[J].浙江師范大學學報,2010,33(2):185-188.

[2]鄭建國,張松平,張羽飛.靜電紡絲制備苯乙烯馬來酸酐共聚物納米纖維及其固定化β-D-半乳糖苷酶[J].過程工程學報,2010,10(4):743-749.

[3]Bahar T,Tuncel A.Immobilidation of invertase on to crosslinked poly(pchloromethylstyrene) beads[J].Appl Polym Sci,2002,83:1268-1279.

[4]黃家賢,霍巖麗,李涵,等.含環(huán)碳酸酯基固定化酶載體的合成及其性能研究[J].中國生物化學與分子生物學報,2001,17(3):377-380.