轉基因動物的相關研究進展

周 揚，張欽愷，潘慶杰

(青島農(nóng)業(yè)大學 動物生殖發(fā)育與基因工程研究所，山東 青島 266109)

轉基因動物(transgenic animal)是在經(jīng)典遺傳學、分子遺傳學、結構遺傳學和DNA重組技術的基礎上，通過實驗方法人為地將人們所需要的目的外源基因導入某種動物的受精卵或早期胚胎細胞，使外源基因與動物本身的基因組整合，隨細胞的分裂而增殖，且能穩(wěn)定地遺傳給后代的一類動物[1]。其實質就是按人們的需要有計劃、有目的地定向改造動物的遺傳組成，賦予轉基因動物新的特征，使之更好地為人類服務。

動物轉基因技術是21世紀發(fā)展最為迅速的生物高新技術之一，它是指通過基因工程技術將外源基因整合到受體動物基因組中，從而使其得以表達和遺傳的生物技術。動物轉基因的關鍵限制因素是轉基因效率和基因表達的精確調控。

1 動物轉基因技術

目前產(chǎn)生轉基因動物的基因轉移技術有多種，主要有顯微注射法、精子載體法、逆轉錄病毒載體感染法以及其他一些新方法等，每一種方法各有其優(yōu)缺點，仍然需要進一步研究。

1.1 顯微注射法

顯微注射法(micro injection)是最先采用的轉基因方法，被廣泛應用并取得了較好的結果。1980年，Gordon首次利用原核注射的方法開展動物轉基因研究[2]。其基本原理是通過顯微操作儀將外源基因直接注入受精卵，利用受精卵繁殖中DNA的復制過程，將外源基因整合到DNA中，發(fā)育成轉基因動物。

這種方法的優(yōu)點是:外源基因易整合入染色體，導入的基因大，可使用任何載體承載基因片段，也可注射無載體的基因片段。外源基因的長度可達100 kb，實驗周期相對比較短。但其不足之處是:由于基因整體進入染色體的隨機性，使外源基因整合位點和拷貝數(shù)無法控制。而且設備昂貴、操作復雜。該方法的外源基因轉移整合率小鼠為6%～10%，豬和羊分別為0.98%和1%，魚類通?？蛇_10% ～15%[3]。

1.2 精子載體法

精子載體法(sperm mediated gene transfer)，即把精子與外源基因的混合溶液，在一定的溫度條件下，保留一定的時間，使精子攜帶有外源基因，當精子與卵子結合時，外源基因便會進入受精卵[4]。

以精子作載體的最大優(yōu)點是:該方法在轉基因家畜生產(chǎn)中具有技術和效率上的優(yōu)勢，克服了人為機械操作給胚胎造成的損傷，且簡單、易行，不需昂貴的顯微操作設施及復雜的操作技巧。主要缺點是:實驗結果不穩(wěn)定，可重復性差。其中進入精子核內(nèi)的DNA結構是否完整、DNA進入精子核內(nèi)的比例有多少、DNA進入核內(nèi)的精子受精能力怎樣，以及其受精后能否成功嵌入胚胎染色體中等，是該技術能否取得長足發(fā)展的最為敏感而又必須解答的問題。

1.3 逆轉錄病毒載體感染法

逆轉錄病毒載體轉染法(retrovirusmediated gene transfer):利用逆轉錄病毒在轉染寄主時可以將病毒的一部分DNA整合到宿主細胞的特點，將體外構建的基因重組到病毒載體上，再用帶有目的基因的病毒轉染動物細胞，以達到將病毒攜帶的目的基因轉入動物細胞的目的[5]。

慢病毒載體法用于制作轉基因動物的優(yōu)點是:方法簡單，不受胚胎發(fā)育階段的影響，而且外源基因多位點、單拷貝整合效率高，特別適用于轉基因家禽的生產(chǎn)。但其也有缺點:存在病毒載體構建復雜，轉入的外源基因的大小受到限制，安全性需提高，可能會造成基因沉默等問題。

1.4 其他新方法

定位整合技術:利用DNA體內(nèi)同源重組的原理，將外源基因穩(wěn)定地插入特定的位點，再經(jīng)適當篩選，從而得到既定的轉化細胞[5]。這一技術不僅為基因定位整合進而為哺乳動物種系改造開拓了道路，而且在缺陷基因的修復以及生命科學的理論研究上，都將有很大的應用價值。

轉座子介導法:轉座子是一類可以進入生物基因組內(nèi)不同位置的基因載體，它可以自主復制并移動，在經(jīng)過切割、重組等過程后，轉座子中可以插入其他位點，且對插入位點之后的基因產(chǎn)生一定的影響。在轉基因研究的應用中，科學家利用它們插入基因導致突變以了解基因功能，也利用它們培育轉基因生物。轉座子是在很多后生動物中發(fā)現(xiàn)的。現(xiàn)主要有兩種代表性的轉座子:Sleepingbeauty(SB)和 PiggyBac(PB)。SB來源于不同的魚類基因組中的有缺陷的拷貝序列進行比對，獲得最原始的轉座子序列，通過點突變獲得有活性轉座子元件。PB則來源于鱗翅目昆蟲。果蠅轉座子作為基因載體是很有希望的真核生物基因工程的載體，可用于確認基因、克隆基因、安置基因回到基因組。復旦大學的丁升、李剛等人[6]在《細胞》雜志上報道了在世界上首次創(chuàng)立了一個高效實用的哺乳動物轉座因子系統(tǒng)，為大規(guī)模研究哺乳動物基因功能提供了新方法。轉座子介導法具有整合率高、承載量大以及更容易找到整合位點等優(yōu)勢。

鋅指核酸酶技術:鋅指核酸酶(Zinc finger nuclease，ZFN)可以特異地識別并剪切DNA片段中特定基因，通過對DNA片段上的特定基因進行靶向修飾產(chǎn)生新型細胞。該技術是能夠應用于動物轉基因上的一種新技術，且已經(jīng)被成功用于動植物的基因改造實驗中，具有非常高的基因整合效率。2003年Poneus等人[7]在美國 《科學》雜志報道了ZFN可以在哺乳動物體細胞上實現(xiàn)基因打靶。2007年 Moehl等人[8]證明了 ZFN技術可顯著提高基因的靶向敲除效率。最近研究發(fā)現(xiàn)，ZFN技術也可以提高同源重組的效率。

2 轉基因動物的研究現(xiàn)狀

2.1 提高動物生長率

生長激素(growth hormone，GH)基因是轉基因研究中應用最早的基因，1982年Palmiter等[9]用顯微注射法首次將大鼠的生長激素基因(rGH)導入到小鼠基因組中并成功表達，獲得了體重為正常小鼠兩倍以上的“碩鼠”。此后，許多科學工作者都希望通過轉移生長激素基因，大幅度提高動物的生長速度，并陸續(xù)培育出轉基因家禽、嚙齒類、魚類、昆蟲等。

最常用的技術是將人的生長激素基因導入魚和其他動物，如Maclean等把人生長激素基因注入虹鱒的受精卵，Dunham等把人生長激素基因注入到斑點叉尾魚，Rokkones等將人生長激素基因注入到大西洋鮭魚和虹鱒。加拿大科學家將一種非?；钴S的生長激素基因注入到太平洋魷魚的魚卵中，經(jīng)過基因重組的魷魚平均重量是普通魷魚的11倍[10]。1985年，朱作言等也將人生長激素基因(hGH)轉入金魚體內(nèi)，獲得的轉基因魚，其生長速度比非轉基因金魚快2倍。

Hammer R E等[11]將生長激素基因導入豬受精卵中，獲得的一頭轉基因豬生長速度明顯較同窩其他豬快，飼料利用率提高了17%，胴體脂肪率明顯降低。Pursel V G等[12]把牛的生長激素基因轉入豬體內(nèi)，所獲得轉基因豬生長速度提高了11%～14%，飼料轉化率提高16%～18%。中國農(nóng)業(yè)大學培育的轉基因豬，生長速度比對照組高40%。但有些轉基因動物卻表現(xiàn)出畸形、患病率和死亡高等現(xiàn)象。因此，20世紀90年代以后，動物轉基因技術的研究主要轉向培育肉質更好的家畜家禽、利用乳腺生物反應器生產(chǎn)藥用蛋白、培育抗病家畜家禽、異種培養(yǎng)人體器官等。

2.2 改良動物經(jīng)濟性狀

改良動物經(jīng)濟性狀有以下幾個方面:提高動物體脂肪質量，提高動物乳品質量和提高羊毛產(chǎn)量和品質等。

有關改進動物脂肪質量方面的研究主要見于豬。Pursel V G等培育的IGF1轉基因豬，脂肪比對照組減少了10%，瘦肉率增加了6% ～8%[12]。美國科學家培育的19頭轉基因豬，將背膘厚度從18.5 mm下降到7.0 mm。日本科學家Saeki將菠菜去飽和酶(fad2)基因轉入豬體內(nèi)，培育出來的6頭轉基因豬體內(nèi)6型不飽和脂肪酸的含量比普通豬高20%[13]。美國密蘇里哥倫比亞大學獲得了10頭轉有線蟲去飽和酶(fat1)基因的體細胞克隆豬，轉基因克隆豬體內(nèi)ω6/ω3的比值達到1～2[14]，遠遠低于正常豬，使豬肉的營養(yǎng)價值得到明顯提高。中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所和軍事醫(yī)學科學院生物工程研究所合作獲得了轉有脂肪酸去飽和酶基因的轉基因克隆豬[15]。這一領域的研究一直受到人們的高度重視。

利用轉基因的方法可使牛、羊產(chǎn)出具有不同特性的可以滿足人類不同需求的轉基因奶。牛奶中的乳糖可引起部分人腹部不適，科學家希望通過敲除合成乳糖的乳白蛋白位點或在乳腺中表達乳糖酶來降低牛奶中的乳糖含量，從而生產(chǎn)出受糖尿病人歡迎的低乳糖奶。黃淑幀等成功培育出了轉有人血清白蛋白(hALB)基因的轉基因牛。Berkel等培育的轉基因牛奶中人乳鐵蛋白的含量為300 μg/mL ～ 2 800 μg/mL， 荷 蘭 的 Gen Pharm公司培育出的轉基因牛，乳中人乳鐵蛋白含量達到1 000 μg/mL[16]。Brophy B 等培育的轉基因牛，奶中酪蛋白和酪蛋白的含量分別比對照組高20%和100%[17]。敲除奶乳球蛋白基因就可以消除過敏原，使其所產(chǎn)的牛奶不會引起人體過敏反應;轉入人乳鐵蛋白基因的牛就可以產(chǎn)出含有大量人乳鐵蛋白的人源化牛奶。李寧等先后成功獲得了轉有人乳清白蛋白、人乳鐵蛋白、人巖藻糖轉移酶、人溶菌酶的轉基因奶牛。RehW A等[18]將大鼠硬脂酰輔酶A的基因轉入羊體內(nèi)，獲得的轉基因羊奶中單不飽和脂肪酸和共軛亞油酸含量明顯提高，這種羊奶對心血管病人的健康非常有益。MagaE A等[19]將人溶菌酶基因轉入奶山羊，使羊奶中含有人溶菌酶。用這種羊奶飼喂仔豬，可顯著降低仔豬胃腸道的大腸埃希菌等數(shù)量，從而證明該轉有人溶菌酶基因的山羊奶可以預防嬰幼兒腹瀉等疾病。目前，全世界從事乳腺生物反應器的商業(yè)化開發(fā)的公司已有十幾家，可以進行商業(yè)生產(chǎn)的藥物有近40種，許多重組蛋白，如抗胰蛋白酶、組織型纖溶酶原激活物(tPA)等已進入臨床試驗階段。

利用轉基因技術可以提高綿羊的產(chǎn)毛量和羊毛品質。Nancarrow等曾把來自于優(yōu)質羊毛的一種A2蛋白的主要成分(半胱氨酸)基因導入綿羊原核期胚胎，使轉基因羊的產(chǎn)毛量得到明顯提高。Bulcock等把人類胰島素生長因子21(IGF21)基因轉入羊的原核胚，使轉基因羊的產(chǎn)毛率得到很大提高。Damak等培育出的轉有IGF1基因的轉基因綿羊平均凈毛量比其非轉基因羊高6.2%[20]。Powell等將毛角蛋白型中間細絲基因導入綿羊基因組并使其在皮質中得到特異表達，結果轉基因羊的羊毛含脂率得到明顯提高，光澤十分亮麗。Lazaris等培育的轉基因山羊，奶中的重組蛛絲蛋白可以紡成高強度絲線，這種絲線可用于軍工和醫(yī)療等，被稱為生物鋼。目前，新西蘭、澳大利亞、英國等國家都在努力開發(fā)一種可以生產(chǎn)彩色羊毛的高產(chǎn)轉基因羊。還有人將貂的長皮毛基因導入羊細胞中，培育出長出類似貂毛皮毛的羊。這類羊容易飼養(yǎng)，繁殖快，所生產(chǎn)的羊貂皮面積比貂皮大幾倍[21]。

2.3 提供生物藥品

利用轉基因技術，可將人們所需要的目的基因直接導入鼠、兔、羊、豬等動物體內(nèi)，使目的基因在其體內(nèi)表達，獲得可用于治療或預防人類疾病的轉基因生物藥品。英國羅斯林研究所不僅培育出世界上第一只克隆羊多利(Dolly)，還培育出能下神奇雞蛋的小雞。這種經(jīng)過基因改造的母雞所下的蛋DNA中含有一種人體干擾素，可用于治療癌癥和其他疾病。上海醫(yī)學遺傳研究所與復旦大學遺傳所合作，于1996年10月成功研制出5頭含有人凝血因子的轉基因羊，經(jīng)檢測，這些轉基因母羊的乳汁中，含有人凝血因子蛋白，這種活性凝血因子是治療血友病的珍貴藥物[22]。

目前很多轉基因動物公司都可以生產(chǎn)抗胰蛋白酶、人紅細胞生成素、乳鐵蛋白、人血白蛋白、人血紅蛋白及人凝血因子、抗凝血酶、血纖維蛋白原、蛋白質C等。我國江蘇省轉基因動物制藥工程研究中心已經(jīng)獲得了乳腺特異表達人生長激素、乙型肝炎病毒表面抗原、促紅細胞生成素、人乳鐵蛋白、人溶菌酶等轉基因山羊、兔、小鼠和雞。

2.4 提供動物模型和器官

中國科學院昆明動物研究所成功地培育出轉基因獼猴。此成果為人類重大疾病的非人靈長類動物模型的深入研究奠定了堅實的基礎。由于非人靈長類在生物學、遺傳學和行為學等方面與人類的高度相似性，使之成為人類疾病理想的、甚至是不可替代的動物模型，在治療、藥理藥效的臨床前安全評價至關重要。轉基因動物模型非常適合人類疾病的研究，特別是那些因遺傳缺陷引起的疾病，轉基因靈長類動物模型能很好表達人類疾病的變異基因。伊斯梅爾教授及其團隊用了7年時間培育出含有15%人類細胞的綿羊[22]。他們認為，這項研究的最終目標是在綿羊體內(nèi)“種”出病人需要的各種可移植器官。假如第一個器官移植失敗，還有很多羊可以提供備用器官。這樣，這種混血綿羊就成為可給人類提供組織器官的“活體工廠”，也可用于藥物試驗。

2.5 提高動物的觀賞價值

利用轉基因動物技術可以生產(chǎn)各種毛色和花紋的觀賞動物。美國和日本在轉基因觀賞動物的研究方面取得了令人矚目的成果。采用顯微注射法將綠色熒光蛋白(GFP)基因重組表達質粒導入金魚受精卵中，得到了發(fā)綠色熒光的金魚。美國得克薩斯的一家公司宣布，經(jīng)過轉基因技術已經(jīng)研制出能發(fā)熒光的小型熱帶熒光魚。這種熒光斑馬魚被分別轉入了水母綠色熒光蛋白或者珊瑚蟲紅色熒光蛋白的基因，在紫外線的照射下，能夠發(fā)出綠光或紅光，而且光芒四射。日本研究人員利用病毒載體將綠色熒光蛋白基因轉入普通狨猴胚胎。結果表明，4只體內(nèi)胚胎被轉入新基因的普通狨猴共生育了5只小普通狨猴，其體內(nèi)也均有轉入的基因，在紫外線照射下，它們腳底等處的皮膚都發(fā)出綠色的熒光。其中2只普通狨猴的生殖細胞中也有轉入綠色熒光蛋白基因，并用其中的1只培育出了第2代體內(nèi)含有綠色熒光蛋白基因的普通狨猴。繼美國和日本之后，我國東北農(nóng)業(yè)大學也培育出來的綠色熒光蛋白的轉基因克隆豬。在紫外線的照射下，這些豬的蹄子、鼻尖、舌頭等無毛部位會發(fā)出熒光。中科院昆明動物研究所給猴子體內(nèi)引入了綠色熒光蛋白，所培育的轉基因猴子受到藍光照射時，就會發(fā)出綠色熒光。當然，培育這些動物的目的并不僅僅在于觀賞，科研工作者希望利用這項技術尋找到治療諸如阿爾茨海默癥和帕金森癥等疾病的方法。

3 轉基因動物的食品安全性

轉基因食品不同于相同生物來源的傳統(tǒng)食品，科學家們還無法預見其基因轉化后產(chǎn)生新的、未知的蛋白質，也不能完全準確的預見對受體的影響。由于轉基因技術本身的不足，轉基因食品的開發(fā)利用還有很大的爭議。雖然中國、美國和加拿大等國家在快速生長的轉基因魚研究方面已經(jīng)取得了突破性進展，但是迄今為止，全世界還沒有轉基因動物食品獲準上市。

3.1 轉基因動物食品的概念

轉基因動物食品到目前還沒有明確的定義。通常把攜帶了外源基因并能將其表達和遺傳的動物稱為轉基因動物[23]。人們可以通過基因工程的方法，使轉基因動物在性狀、營養(yǎng)成分、消費品質等方面向人們需要的目標轉化。因此，可以把這種以轉基因動物為食物或加工原料而生產(chǎn)的食品稱為轉基因動物食品。

3.2 轉基因動物的安全問題

轉基因動物產(chǎn)品的安全問題是其進入產(chǎn)業(yè)化階段的最大障礙之一。轉基因動物本身是否會存在健康和福利問題;轉基因產(chǎn)品是否會對人體健康產(chǎn)生危害;轉基因生物是否會對自然界產(chǎn)生基因污染，破壞生態(tài)平衡，這一系列的問題都還需要充分的證據(jù)來解答。

3.2.1 轉基因動物與其健康

由于外源基因的插入，轉基因動物的某些內(nèi)源基因可能會被破壞或正常表達受到影響，引起轉基因動物非目標性狀的改變，輕則影響其生產(chǎn)性能，重則影響正常生長發(fā)育。Rejduch等[24]對攜帶牛生長激素的轉基因豬的配子發(fā)育和繁殖性能研究，結果發(fā)現(xiàn)轉基因豬交配欲望弱、成功率低、窩產(chǎn)活仔數(shù)平均少3頭。另外，目的基因在轉基因動物體內(nèi)的過度表達也會破壞正常的內(nèi)穩(wěn)態(tài)，從而引起其他生理狀態(tài)的改變。牛奶中重組人血清白蛋白表達水平在40 g/L以上的轉基因牛，其產(chǎn)奶期縮短了，而表達水平在1～2 g/L的轉基因牛則產(chǎn)奶期相對正常。

3.2.2 轉基因動物與食品安全

目前還沒有研究報告顯示轉基因食品確切的危害性。Appel等[25]將轉基因牛生產(chǎn)的人重組乳鐵蛋白飼喂小鼠，連續(xù)飼喂13周后對小鼠進行臨床及行為學觀察、生理生化指標檢測、全身和不同組織器官的顯微檢測，結果顯示，實驗組小鼠沒有出現(xiàn)明顯的不良臨床反應。

3.2.3 轉基因動物與環(huán)境

轉基因動物可能會和野生型或其他物種雜交發(fā)生基因漂移，危及生態(tài)。轉基因動物的飼養(yǎng)管理方式，其對環(huán)境產(chǎn)生的威脅遠低于轉基因植物、微生物和魚等生物。但轉基因動物可以通過與野生型動物發(fā)生遺傳交流來擴散外源基因;另一方面，轉基因動物的排泄物可能含有轉基因產(chǎn)物，對環(huán)境以及人產(chǎn)生潛在的威脅。Wheeler等[26]對攜帶牛α-乳清蛋白的轉基因豬進行環(huán)境風險評估，對與轉基因豬同圈飼養(yǎng)的非轉基因豬、與轉基因雄性豬交配2天或7天的雌性非轉基因豬的多種器官和組織進行PCR檢測，沒有發(fā)現(xiàn)外源基因的存在。

3.3 轉基因動物食品的安全性評價

轉基因食品食用安全性評價的基本原則有科學原則、實質等同性原則、個案原則和逐步原則等。其中實質等同性原則是安全性評價的起點，它是指以有安全食用歷史的傳統(tǒng)食品為基礎，要求轉基因食品和它所替代的傳統(tǒng)食品至少要同樣安全[27]。

安全性評價的內(nèi)容包括外源基因的安全性、基因載體的安全性、轉基因過程(插入序列、插入位點、插入序列拷貝數(shù)等)、基因插入引起的副作用、基因重組的非預期效應、新表達物質的毒性和致敏性、轉基因動物的健康狀況、轉基因動物及其產(chǎn)品營養(yǎng)成分分析、轉基因動物食品在膳食中的作用和暴露水平、食品加工過程對食物的影響、對人體抗病能力的影響以及售后去向和消費人群的流行病學調查[28]。另外，根據(jù)所使用的基因重組的方法，還要評價基因載體的感染性，載體上調控元件對宿主細胞的潛在效應，以及調控元件與內(nèi)源性致病序列發(fā)生整合的可能性，但目前還沒有合適的方法進行這方面的安全性評價。

但是實驗動物的食品安全性實驗與以人類健康影響為目的的食用安全性評價有一定差距。因此，要真正對轉基因動物進行食品安全性的評價，還需要逐漸建立一套科學健全的評價標準和實驗方法。

4 前景

21世紀是生物技術蓬勃發(fā)展的時代，要促進我國轉基因技術和轉基因食品產(chǎn)業(yè)的健康快速發(fā)展，應該制定適合我國國情的轉基因產(chǎn)業(yè)發(fā)展和生物安全管理政策，正確評估轉基因食品的安全性，對轉基因技術和食品進行有效評估和監(jiān)控。轉基因動物的成功研制為動物類研究和開發(fā)提供了一個廣闊前景。在各項條件成熟與完備之后，轉基因動物必將大量研制出來并投入大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)，它將豐富人們的食品市場，并產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟價值和社會價值。

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