化瘀方抗大鼠心肌纖維化療效及其與氧化應(yīng)激的關(guān)系

劉 馨，陳 凱，隋育坤，張宇彬，管怡晴，張國華△

(南方醫(yī)科大學(xué)：1.中醫(yī)藥學(xué)院；2.藥學(xué)院，廣州 510515)

心肌纖維化(myocardial fibrosis，MF)是指心肌間質(zhì)膠原纖維過度沉積，導(dǎo)致心力衰竭和心室肥厚[1-2]。氧化應(yīng)激是由于體內(nèi)抗氧化酶和氧自由基失衡，其在MF的發(fā)生過程中起著重要作用[3]。本課題組前期已證實(shí)血府逐瘀湯抗MF療效顯著[4]，但血府逐瘀湯成分復(fù)雜，具體作用機(jī)制尚不清楚。拆方研究是中醫(yī)復(fù)方研究的傳統(tǒng)手段，其通過精簡復(fù)方，觀察療效變化，從而尋找最有效的配伍組合[5]。因此，本研究以精簡組方但不降低療效為目的，對血府逐瘀湯進(jìn)行拆方研究，預(yù)測化瘀方可能是血府逐瘀湯抗MF的有效藥物組合，對其進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，并研究其與氧化應(yīng)激的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物 30只12周齡的自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rat,SHR)和5只同齡雄性Wistar-Kyoto(WKY)大鼠(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，編號：SCXK2016-0011)。

1.2藥品及儀器 血府逐瘀湯組方免煎顆粒、化瘀方組方免煎顆粒及卡托普利均購自南方醫(yī)科大學(xué)附屬南方醫(yī)院。彩色多普勒超聲診斷儀(S40，深圳開立科技有限公司)；無創(chuàng)尾壓儀(ALC-NIBP，上海奧爾科特生物科技有限公司)；倒置光學(xué)顯微鏡(BS-51，日本奧林巴斯公司)。

1.3方法

1.3.1網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是新起的中藥復(fù)方的研究方法[6]，它基于系統(tǒng)生物學(xué)理論，對生物系統(tǒng)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析的新學(xué)科[7]。BATMAN-TCM(http://bionet.ncpsb.org/BATMAN-TCM)是首個用于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析的中醫(yī)分子機(jī)制研究工具。根據(jù)中醫(yī)病理機(jī)制，血府逐瘀湯分為4個獨(dú)立方，(1)化瘀方：桃仁、紅花、川芎、赤芍、牛膝；(2)行氣方：枳殼、桔梗、柴胡；(3)養(yǎng)血方：當(dāng)歸、生地；(4)調(diào)和方：甘草。BATMAN-TCM中拼音輸入4個獨(dú)立方的草藥名。設(shè)置參數(shù)：預(yù)測候選靶點(diǎn)數(shù)不低于20；調(diào)整P<0.05。分別構(gòu)建其“活性成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖。發(fā)現(xiàn)與行氣方、養(yǎng)血方和調(diào)和方比較，化瘀方網(wǎng)絡(luò)圖的節(jié)點(diǎn)和連接最多，數(shù)據(jù)分析顯示化瘀方可用于治療高血壓、心力衰竭、心血管疾病等。結(jié)合中醫(yī)理論和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，預(yù)測化瘀方可能為血府逐瘀湯抗心肌纖維化的有效藥物組合。

1.3.2分組 SHR分為6組：模型組、化瘀方低劑量組(2 g/kg)、化瘀方中劑量組(4 g/kg)、化瘀方高劑量組(8 g/kg)、血府逐瘀湯組(16 g/kg)和卡托普利組(13.5 mg/kg),每組5只。5只WKY作為正常對照組。除正常對照組和模型組分別給予等量蒸餾水外，各組大鼠均灌胃給藥，連續(xù)給藥12周。

1.3.3超聲心動圖檢測 多普勒超聲儀檢查大鼠心臟功能。2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠后胸部備皮，M型模式下獲得左心室長軸視圖的穩(wěn)定圖像，觀察并計(jì)算射血分?jǐn)?shù)和短軸縮短率，其為評價(jià)心功能的敏感指標(biāo)，下降則提示心力衰竭[8]。

1.3.4無創(chuàng)尾壓儀檢測 尾套法對大鼠進(jìn)行尾動脈測量。老鼠置于裝有保溫墊(溫度為37～38 ℃)的大鼠固定器中，將鼠尾置于加壓套內(nèi)，大鼠安靜穩(wěn)定2～3 min后儀器顯示出穩(wěn)定的脈搏波，按下開始鍵開始自動測量。

1.3.5生化指標(biāo)檢測 末次給藥后，大鼠腹主動脈取血，靜置離心后取上清液。按生化試劑盒說明書檢測血清中心肌標(biāo)志物：肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶MB (CK-MB)和乳酸脫氫酶 (LDH),其為心肌壞死的特異標(biāo)記物[9]。準(zhǔn)確稱取心肌組織，加生理鹽水機(jī)械勻漿，離心取上清液。先BCA比色法測量蛋白濃度，然后按生化試劑盒說明書檢測氧化指標(biāo)：過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)和超氧化物歧化酶(SOD)。

1.3.6蘇木精-伊紅(HE)染色和Masson染色 心肌組織4%多聚甲醛固定，石蠟包埋切片后，進(jìn)行HE染色和Masson染色，于顯微鏡下隨機(jī)視野拍照觀察。

1.3.7反轉(zhuǎn)錄PCR(qRT-PCR) 提取心肌組織中總RNA，檢測樣品濃度及純度。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系反轉(zhuǎn)為cDNA，配制qRT-PCR反應(yīng)液，設(shè)定qRT-PCR反應(yīng)條件，定量分析反應(yīng)模板，根據(jù)2-△△Ct法計(jì)算CAT、GPx和SOD的mRNA水平。

1.3.8Western blot法 提取心臟組織蛋白，BCA比色法測量蛋白水平，定量后樣品煮沸5 min，上樣后置于電泳緩沖液中電泳，分離目的蛋白(CAT、GPx和SOD)，100 V電壓轉(zhuǎn)膜90 min，5%牛奶室溫封閉1 h，一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗膜，二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜，ECL顯色，曝光掃描。

2 結(jié) 果

2.1心血管指標(biāo)和血流動力學(xué)參數(shù)檢測 與正常對照組比較，模型組的射血分?jǐn)?shù)和短軸縮短率顯著降低(P<0.05)，收縮壓、舒張壓和平均動脈壓顯著升高(P<0.05)，化瘀方治療后能顯著增加射血分?jǐn)?shù)和短軸縮短率(P<0.05)，降低收縮壓、舒張壓和平均動脈壓(P<0.05)，高劑量化瘀方的降壓效果與血府逐瘀湯相當(dāng)，見表1。

2.3心肌標(biāo)記物檢測 與正常對照組比較，模型組的CK和CK-MB均顯著升高(P<0.05)?；龇街委熀驝K和CK-MB較模型組顯著降低(P<0.05)，化瘀方高劑量組治療效果優(yōu)于血府逐瘀湯組(P<0.05)，LDH各組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖1。

a：P<0.05，與正常對照組比較；b：P<0.05，與模型組比較

2.3HE染色和Masson染色 HE染色結(jié)果顯示：模型組的心肌細(xì)胞排列紊亂，出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞，并發(fā)生浸潤?；龇降汀⒅?、高劑量組炎性細(xì)胞減少，炎性細(xì)胞浸潤程度減輕，化瘀方能有效減輕心肌病理改變。Masson染色結(jié)果顯示：與正常對照組比較，模型組的心肌膠原纖維顯著增多，排列紊亂?；龇降汀⒅?、高劑量組的心肌纖維排列有序，心肌中膠原纖維減少，見圖2、3。

2.4抗氧化酶檢測 模型組血清及心肌組織中CAT和GPx顯著低于正常對照組(P<0.05)，化瘀方高劑量治療后能顯著增加CAT和GPx的表達(dá)(P<0.05)。各組血清及心肌組織中SOD比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與正常對照組比較，CAT和GPx mRNA表達(dá)降低(P<0.05),化瘀方治療后增加了CAT和GPx mRNA表達(dá)(P<0.05)。各組SOD mRNA表達(dá)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2、圖4。

表1 各組射血分?jǐn)?shù)、短軸縮短率、收縮壓、舒張壓、平均動脈壓和心率的比較

a:P<0.05，與正常對照組比較；b：P<0.05，與模型組比較

A:正常對照組；B：模型組；C：化瘀方低劑量組；D：化瘀方中劑量組；E：化瘀方高劑量組；F：血府逐瘀湯組；G：卡托普利組

表2 各組血清及心肌組織中CAT、GPx和SOD水平比較

a:P<0.05，與正常對照組比較；b：P<0.05，與模型組比較

A:CAT；B:GPx；C:SOD;a：P<0.05，與正常對照組比較；b：P<0.05，與模型組比較

3 討 論

心肌纖維化發(fā)病過程中，高血壓是致心室重構(gòu)的一個重要原因[10]。氧化應(yīng)激與高血壓的發(fā)生、發(fā)展存在因果關(guān)系。氧化應(yīng)激既引起血管壁增厚和血管腔狹窄，又損傷內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙，血管舒張性降低，增加血管收縮，引起外周血管阻力增加和血壓升高[11]。CAT、GPx和SOD是抗氧化應(yīng)激的一線防御酶[12]，高血壓引起的心肌纖維化與抗氧化酶減少密切相關(guān)[13-14]。因此，評價(jià)心肌氧化應(yīng)激程度有助于研究藥物的藥效及探究其病理機(jī)制。

結(jié)合中醫(yī)理論和臨床實(shí)際，血瘀脈阻是導(dǎo)致心肌纖維化發(fā)生的主要原因[15]。因此對于心肌纖維化的治療，關(guān)鍵在于改善體內(nèi)瘀血。大量研究表明，具有化瘀功效的復(fù)方可以治療心肌纖維化，如扶正化瘀膠囊[16]、益氣化瘀湯[17]等。本研究團(tuán)隊(duì)亦驗(yàn)證了具有活血化瘀作用的血府逐瘀湯具有抗心肌纖維化的作用[4]?；谝陨习l(fā)現(xiàn)，本研究推測，在抗心肌纖維化方面，化瘀方是血府逐瘀湯發(fā)揮作用的有效藥物組合。BATMAN-TCM分析結(jié)果也與筆者的猜想相符。血府逐瘀湯成分復(fù)雜，不利于深入研究其具體藥理作用及潛在的作用機(jī)制。因此，筆者對11味藥物組合的血府逐瘀湯進(jìn)行拆方研究，預(yù)測5味藥物組合的化瘀方是血府逐瘀湯抗心肌纖維化的有效藥物組合。

選材方面，SHR是1963年培育成功的高血壓模型大鼠，4周齡后，其血壓逐漸增高，10周齡后開始出現(xiàn)心功能下降，導(dǎo)致心肌纖維化[18]。目前已廣泛用于研究高血壓疾病，WKY常作為SHR的正常對照組[19-20]。因此，本研究選取12周齡的SHR，模擬人體高血壓情況。本研究中，模型組的血壓、CK和CK-MB增加，射血分?jǐn)?shù)和短軸縮短率降低，膠原纖維顯著增多。化瘀方治療后能逆轉(zhuǎn)這些指標(biāo)，減少纖維增生。隨著化瘀方濃度的增高，其抗心臟損害效果越好，化瘀方高劑量組療效不劣于血府逐瘀湯?；龇侥茱@著逆轉(zhuǎn)心肌纖維化，這種作用可能與降壓和改善心功能有關(guān)。另外，本研究通過觀察抗氧化酶的活性，評價(jià)大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激的變化。發(fā)現(xiàn)化瘀方治療增加了CAT和GPx活性，并增加了CAT和GPx的mRNA和蛋白的表達(dá)。這說明化瘀方可能通過減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而調(diào)節(jié)心臟收縮功能和血壓，對心肌纖維化起治療作用。

綜上，在抗心肌纖維化方面，化瘀方是血府逐瘀湯發(fā)揮作用的有效藥物組合，其作用可能與減輕氧化應(yīng)激有關(guān)。化瘀方由5味中藥組成，組方更加精簡，并且其藥效不劣于全方，有利于以抽絲剝繭的方式深入開展藥理研究及機(jī)制研究。然而，化瘀方的具體作用靶點(diǎn)及潛在機(jī)制目前尚不清楚，仍需進(jìn)一步深入探索。