非酒精性脂肪肝動(dòng)物模型研究進(jìn)展

李強(qiáng) 傅繼華

（1 中國藥科大學(xué)2010 級(jí)藥理學(xué)碩士研究生 江蘇南京210009；2 中國藥科大學(xué)生理教研室 江蘇南京210009）

非酒精性脂肪肝 (Non-alcoholic Fatty Liver Disease,NAFLD)是一種無過量飲酒史，但病理學(xué)改變類似酒精性脂肪性肝病，以肝細(xì)胞脂肪變性和脂質(zhì)貯積為特征的臨床病理綜合征[1]。近年來隨著人民生活水平的提高，高熱量的飲食習(xí)慣和不良的生活方式使得肥胖、高脂血癥、糖尿病及由此引起的NAFLD 的發(fā)病率有明顯上升的趨勢。雖然脂肪肝被認(rèn)為是良性病變，但它是許多慢性肝臟疾病的早期階段。

1 NAFLD 的發(fā)病機(jī)制

“二次打擊”學(xué)說是Day 等在1998 年提出的[2]，目前已被廣泛接受。一次打擊主要是胰島素抵抗導(dǎo)致肝細(xì)胞脂肪變性，形成單純性脂肪肝。二次打擊因素通過增強(qiáng)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)和(或)刺激Kupfer 細(xì)胞釋放炎性介質(zhì)，引起脂肪變性的肝細(xì)胞發(fā)生氣球樣變和點(diǎn)狀壞死，同時(shí)吸引中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞趨化至肝小葉內(nèi)，形成脂肪性肝炎。并在此基礎(chǔ)上促進(jìn)肝星狀細(xì)胞激活、轉(zhuǎn)化和合成細(xì)胞外基質(zhì)，從而誘發(fā)進(jìn)展性肝纖維化。

2 NAFLD 的動(dòng)物模型研究

目前對(duì)脂肪肝的防治研究日益成為醫(yī)學(xué)關(guān)注和研究的焦點(diǎn)，建立不同方法不同因素誘發(fā)的脂肪肝動(dòng)物模型對(duì)脂肪肝的發(fā)病機(jī)制研究和藥物治療開發(fā)尤為重要。NAFLD 動(dòng)物模型采用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物主要有大鼠、小鼠、沙鼠、家兔、家鴨、小型豬等，但以大鼠造模最為常見。本文重點(diǎn)圍繞大鼠NAFLD模型的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

2.1 營養(yǎng)失調(diào)性脂肪肝模型 此類模型是通過12周以上的高脂肪、高膽固醇和/或高糖高淀粉飼料喂養(yǎng)誘發(fā)的非酒性脂肪肝模型。成模標(biāo)準(zhǔn)是造模組相對(duì)于對(duì)照組，血清甘油三酯(Triglyceride,TG)、總膽固醇(Total Cholesterol, TC)、游離脂肪酸(Free Fatty Acid, FFA) 和低密度脂蛋白 (Low Density Lipoprotein,LDL)等水平顯著升高；肝臟TC、TG 和FFA 等水平顯著升高；肝細(xì)胞明顯水腫，胞漿內(nèi)出現(xiàn)大小不等的脂滴，呈肝細(xì)胞脂肪變性，偶見肝細(xì)胞點(diǎn)狀壞死或炎癥等。

2.1.1 高脂飼料誘發(fā)脂肪肝模型 高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD 模型在發(fā)病機(jī)制上與人類NAFLD 最相似，且多合并肥胖、胰島素抵抗及其他代謝綜合征的組分。高脂飲食構(gòu)造原理基本一致(增加游離脂肪酸的攝取或合成)，主要差別在于飲食中脂肪比例不等(10%～71%)，含或不含高碳水化合物。有研究表明脂肪含量占28%以上的飲食可使動(dòng)物出現(xiàn)肥胖[3]。在普通飼料中添加豬油或花生油等高脂肪含量物質(zhì)，可促進(jìn)過氧化反應(yīng)發(fā)生，產(chǎn)生自由基和醛類物質(zhì)，醛類物質(zhì)可與抗氧化劑的活性部位結(jié)合，減少自由基的清除，加速NAFLD 的形成。Aragno 等[4]采用普通飼料添加15%豬油和4%膽固醇飼養(yǎng)大鼠15 周，生化指標(biāo)顯示模型組大鼠體重、肝指數(shù)、肝臟TG、TC、FFA、LDL 水平均顯著高于對(duì)照組，肝臟病理學(xué)切片顯示模型組大鼠肝臟脂肪沉積明顯增加。高思源等[5]采用高脂飼料喂養(yǎng)大鼠并結(jié)合慢性應(yīng)激，12 周后發(fā)現(xiàn)肝臟水溶性總膽固醇、三酰甘油含量明顯升高，肝臟LXRα、PPARγ mRNA 表達(dá)進(jìn)一步下調(diào)，血皮質(zhì)醇濃度升高，用此方法建立NAFLD 模型的過程可能更接近于人類NAFLD 病人的發(fā)病過程。高脂飼料誘發(fā)脂肪肝模型所用飼料的營養(yǎng)結(jié)構(gòu)與西方人群的飲食結(jié)構(gòu)類似，都是以動(dòng)物脂肪為主要的能量來源，可以作為模擬西方人群脂肪肝疾病的動(dòng)物模型。

2.1.2 高碳水化合物誘發(fā)脂肪肝模型 在普通飼料中添加蔗糖或玉米粉等高糖高淀粉含量物質(zhì)，可增加長鏈脂肪酸的合成而使TG 的合成增加，并且當(dāng)血糖升高時(shí)，NADPH 供應(yīng)充分，使乙酰輔酶A 轉(zhuǎn)變成的膽固醇增加。在Wistar 大鼠的飲用水中加入10%蔗糖，48 h 內(nèi)即能在其體內(nèi)觀察到脂肪酸合成增加。SD 大鼠經(jīng)含糖量極高(蔗糖70%)的飲食喂養(yǎng)后出現(xiàn)肥胖，2～3 周可形成脂肪肝，伴參與脂肪合成的酶類及煙酰胺腺嘌呤二核苷酸合成增加[6]。Fu等[7]采用普通飼料添加15%玉米粉和3%膽固醇飼養(yǎng)大鼠12 周，生化指標(biāo)顯示模型組大鼠肝臟TC、TG 水平，血清TC、TG 和LDL 水平顯著高于對(duì)照組。肝臟病理學(xué)切片顯示模型組大鼠肝細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大泡性和小泡性脂肪變性。該模型所用飼料的營養(yǎng)結(jié)構(gòu)與東方人群的飲食結(jié)構(gòu)類似，都是以糖類為主要的能量來源，可以作為模擬東方人群脂肪肝疾病的動(dòng)物模型。

上述兩種模型操作方法簡便，價(jià)格低廉，重復(fù)性好，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡率低，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員無毒，病變過程與人類脂肪肝形成過程類似，病變后逆轉(zhuǎn)緩慢適合藥物干預(yù)治療，是國內(nèi)外常用的脂肪肝模型。但是造模時(shí)間長，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物易產(chǎn)生厭食、腹瀉等不良反應(yīng)。

2.1.3 膽堿-蛋氨酸缺乏(Methionine-Choline Deficiency， MCD)飲食脂肪肝模型 MCD 飲食脂肪肝模型是由美國Harlan Teklad 實(shí)驗(yàn)室開創(chuàng)[8]。膽堿又稱為VitB4，是卵磷脂、乙酰膽堿等物質(zhì)的組成成分。當(dāng)缺少膽堿時(shí)，肝臟合成磷脂減少，不能有效地合成脂蛋白, 特別是極低密度脂蛋白(VLDL)；而VLDL 是運(yùn)輸內(nèi)源性甘油三酯出肝的主要形式，從而使甘油三酯在肝臟內(nèi)積聚，迅速沉積，形成脂肪肝。積累在肝的甘油三酯代謝生成甘油二酯，膽堿與甘油二酯生成卵磷脂減少會(huì)導(dǎo)致甘油二酯積累，結(jié)果細(xì)胞膜中的卵磷脂會(huì)被代謝以提供膽堿，引起肝細(xì)胞膜損傷[9]。MCD 飲食喂養(yǎng)的嚙齒類動(dòng)物，肝組織出現(xiàn)腺泡3 區(qū)嚴(yán)重脂肪變，隨后見到以淋巴細(xì)胞和多形核白細(xì)胞浸潤為主的壞死性炎癥，進(jìn)一步發(fā)展形成細(xì)胞周圍及中央靜脈周圍纖維化[10]。George 等[11]采用MCD 飲食飼養(yǎng)大鼠17 周，肝臟病理學(xué)切片顯示模型組大鼠肝臟2 周后出現(xiàn)輕微脂肪變性，5 周后出現(xiàn)大泡性脂肪變性、炎癥細(xì)胞浸潤和肝小葉病變。該模型是經(jīng)典的非酒精性脂肪性肝炎動(dòng)物模型，操作方法簡便，造模時(shí)間短，應(yīng)用極為廣泛。但是MCD 飼料價(jià)格昂貴，且人類肝臟不含膽堿氧化酶，不存在膽堿缺乏問題，所以該模型的發(fā)病機(jī)制與人類完全不同，它最大的缺點(diǎn)是缺乏人類NAFLD 所具有的胰島素抵抗。目前，該模型主要用于脂肪肝治療藥物的篩選，并可為非肥胖而伴NAFLD 等特殊脂肪營養(yǎng)障礙疾病提供研究思路。2.1.4 全腸外營養(yǎng)(TotalParenteralNutrition,TPN) 脂肪肝模型 TPN 是由賓夕法尼亞大學(xué)的Dudrick 在1968 年首次臨床報(bào)道[12]，成年Wistar 大鼠深靜脈插管，電腦輸液泵將營養(yǎng)液以3 mL/h 的速度持續(xù)滴注，當(dāng)腸外營養(yǎng)液中非蛋白能量達(dá)到33%以上或總攝入量占總熱量83%以上時(shí)，1 周后大鼠肝臟即出現(xiàn)明顯的脂肪變性，主要是由于甘油三酯積聚所致，此外，尚存在血清VLDL 明顯降低，提示肝臟分泌甘油三脂受抑。Ling 等[13]采用TPN 造模4 d，生化指標(biāo)顯示模型組大鼠血清C- 反應(yīng)蛋白(C-Reactive Protein，CRP) 和肝臟TG 水平均顯著高于對(duì)照組，血清TG 水平顯著低于對(duì)照組。該模型造模時(shí)間短，形成率高，但是由于操作方法復(fù)雜，限制了該模型的推廣應(yīng)用。

2.2 藥物中毒性脂肪肝模型 藥物或化合物作用引起肝臟脂肪變性，使肝細(xì)胞脂質(zhì)成分的合成和(或)攝入增加，或釋放和代謝減低，均能使脂肪在肝細(xì)胞內(nèi)堆積，甚至常常為多種機(jī)制同時(shí)參與、協(xié)同促進(jìn)脂肪變性的發(fā)生。以下兩種模型操作方法簡便，造模時(shí)間短，形成率高，但呈急性病變過程，與人類脂肪肝的發(fā)病機(jī)制和病理生理學(xué)改變有著本質(zhì)的區(qū)別，由于藥物具有較大的毒性，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡率高，且對(duì)實(shí)驗(yàn)人員有一定的毒性。

2.2.1 四氯化碳(carbontetrachloride,CCl4)脂肪肝模型 CCl4是最早采用的實(shí)驗(yàn)性脂肪肝模型誘導(dǎo)劑。主要機(jī)制可能與CCl4誘導(dǎo)CYP2E1 激活及嚴(yán)重脂質(zhì)過氧化反應(yīng)造成肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能破壞有關(guān)[14]。Fang 等[15]采用2 mL/kg CCl4灌胃，一周2次，持續(xù)8 周，生化指標(biāo)顯示模型組大鼠肝臟腫大率達(dá)185，TG、MDA 水平顯著高于對(duì)照組。

2.2.2 乙硫氨酸脂肪肝模型 灌胃給予雄性Wistar大鼠乙硫氨酸0.25 g/kg，48 h 后血清三酰甘油、總膽固醇、脂蛋白減少，血清酶輕度升高，肝內(nèi)三酰甘油含量明顯升高，病理表現(xiàn)為肝細(xì)胞肥大，肝竇消失，肝細(xì)胞核旁胞漿空殼，部分形成明顯脂滴，偶見炎性細(xì)胞浸潤，無明顯壞死及纖維化[16]。Furuhama等[17]在大鼠飲食中加入0.25%的DL-乙硫氨酸，持續(xù)2 周，生化指標(biāo)顯示模型組大鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase,ALT) 和總膽固醇含量顯著升高，肝臟病理學(xué)切片顯示模型組大鼠肝臟出現(xiàn)嚴(yán)重的脂質(zhì)沉積和纖維化。

2.3 特殊品系脂肪肝模型 特殊品系脂肪肝大鼠是一類由人工選育的，可先天或自發(fā)形成脂肪肝，無需后天給藥或調(diào)整飲食結(jié)構(gòu)的動(dòng)物模型。以下兩種模型可用于并發(fā)代謝綜合征的脂肪肝的研究，而不適用于后天營養(yǎng)失調(diào)所致脂肪肝的研究。特殊品系大鼠來源較為稀少，價(jià)格昂貴，且死亡率較高，僅適于特定病理機(jī)制的研究。

2.3.1 遺傳性肥胖Zucker 大鼠 遺傳性肥胖Zucker 大鼠是一種著名的并得到廣泛應(yīng)用的遺傳性肥胖病模型，可發(fā)生高胰島素血癥、胰島素抵抗而自發(fā)形成糖尿病、肥胖和脂肪肝。Flamment 等[18]證明遺傳性肥胖Zucker 大鼠的體重、肝臟重量、肝臟TG 含量、血糖、胰島素、瘦素、脂聯(lián)素水平均明顯高于普通Zucker 大鼠。

2.3.2 BHE 大鼠 BHE 大鼠是一種生后300 d 自發(fā)形成糖耐量異常，血糖、血脂顯著升高，形成高脂血癥、脂肪肝，但無肥胖的特殊種系[19]。該品系主要用于2 型糖尿病的研究，作為脂肪肝模型應(yīng)用并不廣泛。

3 NAFLD 模型研究展望

一個(gè)理想的動(dòng)物模型符合以下標(biāo)準(zhǔn)：（1）發(fā)病特征與人類脂肪肝病變特征相似；（2）病變有一定發(fā)展過程；（3）形成率高，死亡率低，可控性強(qiáng)，重復(fù)性好；（4）造模方法簡便易行，價(jià)格低廉。在上述幾種非酒精性脂肪肝模型中，采用高脂飼料誘導(dǎo)的脂肪肝模型因其操作方法簡便，價(jià)格低廉，重復(fù)性好，死亡率低，是國內(nèi)外最常用的造模方法。但是由于人體機(jī)體功能的復(fù)雜性和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種族差異性，以及動(dòng)物年齡、飼料配方、造模時(shí)間以及模型判定指標(biāo)等方面仍缺乏相對(duì)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，使任何一種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型都不能全面模擬人類非酒精性脂肪肝的演變過程，無法準(zhǔn)確地反映脂肪肝疾病的本質(zhì)，難以滿足所有脂肪肝疾病的科研需要，因此，建立一個(gè)能完全反映人類脂肪肝的動(dòng)物模型比較困難。總之，不同造模方法所形成的脂肪肝模型在發(fā)病機(jī)制和病理改變等方面具有本質(zhì)的差別，需根據(jù)實(shí)驗(yàn)研究目的的不同，選擇符合人類脂肪肝形成過程及病變特征、造模時(shí)間短、動(dòng)物死亡率低、重復(fù)性好、操作方法較簡便的動(dòng)物模型進(jìn)行相關(guān)研究。

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