乙型肝炎病毒感染與肝星狀細胞的活化增殖*

張 寧 綜述 黃 堅 審校

在各種慢性肝臟疾病進展過程中，由于肝內(nèi)纖維生成與降解失衡，致使過多的細胞外基質(zhì)在肝內(nèi)沉積，導(dǎo)致肝纖維化形成，常伴有炎癥并可發(fā)展為肝硬化。其中，肝星狀細胞（hepatic stellate cell，HSC）的活化增殖是肝纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)[1]。在各種致病因素中，乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染與肝纖維化的發(fā)生密切相關(guān)。眾所周知，HBV可以通過炎癥反應(yīng)間接作用于HSC促進肝纖維化的發(fā)生，但是在肝臟無明顯炎癥壞死的病人中也會有纖維化的發(fā)生，提示HBV可以直接促進HSC的活化增殖。最近有關(guān)HBV感染導(dǎo)致肝纖維化發(fā)生機制的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，HBV可直接作用于HSC在肝纖維化發(fā)生過程中發(fā)揮作用。本文就肝纖維化發(fā)生過程中HBV對HSC間接與直接作用的最新研究進展進行綜述。

一、HBV感染與HSC的活化增殖

以往認為在慢性HBV感染過程中，各種致肝損傷的因素引起肝臟膠原沉積，從而導(dǎo)致肝臟纖維化，其中炎癥以及免疫等因素發(fā)揮著重要的作用。這些患者血清炎性因子分泌增加，轉(zhuǎn)氨酶水平升高。例如，Ying等[2]的研究中發(fā)現(xiàn)，慢性HBV感染的病人，其肝臟炎癥以及纖維化程度在血清谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）與門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST)比值升高者更加明顯。但是在一些慢性HBV感染的患者中，其血清（轉(zhuǎn)氨酶）和組織學(xué)指標（肝穿刺病理檢查炎癥分級）并未顯示出明顯的肝臟炎癥壞死，若干年后也進展為肝纖維化甚至肝硬化。

近年研究也發(fā)現(xiàn)，ALT持續(xù)正常的慢性HBV感染者中，部分患者的肝組織也會有不同程度的纖維化或炎癥表現(xiàn)：Seto等[3]對乙型肝炎病毒e抗原（hepatitis B virus e antigen，HBeAg）陽性病人的研究發(fā)現(xiàn)，40例ALT持續(xù)正常者，其中9例（22.5%）有明顯的組織學(xué)異常；Lai等[4]的研究中，59例ALT持續(xù)正常者，有37%的患者有顯著的纖維化或炎癥表現(xiàn)。并且，在以上HBeAg陰性病人的研究中顯示，血清ALT持續(xù)正常者，高水平的血清HBV DNA與肝臟纖維化程度相關(guān)[3，4]。

以上研究表明，在慢性HBV感染相關(guān)的肝纖維化中，肝細胞雖然沒有明顯的受損（臨床表現(xiàn)為血清ALT正常），但是肝臟仍然有不同程度的纖維化發(fā)生，并且纖維化的程度與血清中高水平的HBV DNA明顯相關(guān)。HBV是否可以直接作用于肝星狀細胞促進肝纖維化尚且有待研究。

在慢性HBV感染病人治療與隨訪過程中，主要使用血清HBV DNA水平、血清ALT/AST比值等對患者進行監(jiān)測，并且可以結(jié)合肝穿的組織病理學(xué)結(jié)果對疾病階段進行評估。除以上臨床水平的研究之外，我們還應(yīng)該對肝纖維化的發(fā)生機制進行更加深入的研究。

二、HBV作用于HSC的機制

目前的研究認為，許多致肝臟慢性損傷的因素可能均是通過相似的機制導(dǎo)致肝纖維化的形成，最廣為接受的是Friedman等提出的肝星狀細胞（HSC）激活理論[5]。在各種致肝損傷因素的作用下HSC激活，細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）沉積，肝纖維化形成。多年來人們認為HBV感染后HSC的激活過程可能也是如此，但HBV致肝纖維化發(fā)生的確切機制尚不清楚。目前的研究認為，HBV可以間接或直接作用于HSC促進肝纖維化的發(fā)生。

（一）HBV間接作用于HSC HSC在慢性HBV感染所致肝纖維化的過程中發(fā)揮重要的作用。宿主遺傳因素以及病毒基因變異等因素對HSC作用的發(fā)揮有明顯的影響。并且，HBV與機體免疫系統(tǒng)的相互作用以及其所導(dǎo)致的肝臟炎癥壞死等相關(guān)因素也會對肝纖維化進展造成明顯的影響。

研究顯示，在慢性HBV感染的病人中，肝臟纖維化程度與宿主基因的多態(tài)性相關(guān)。例如，白細胞介素-28（interleukin-28，IL-28）基因-251多態(tài)性與肝硬化的發(fā)生明顯相關(guān)，其中TT基因型為易感基因，AA基因型為保護基因[6]；雌激素受體（estrogen receptor，ER）基因的多態(tài)性與HBV所致的肝硬化相關(guān)，P基因為易感基因，p基因為保護基因；谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶基因多態(tài)性（M1、P1和T1）與HBV引起的疾病進展相關(guān)，并且由于基因型M1與P1型的差異，活化的HSC在消除脂質(zhì)過氧化反應(yīng)時的能力不同[7]。

在慢性乙肝病毒感染的過程中，HBV基因組的高變異率與疾病的進展（發(fā)展為肝硬化與肝細胞癌）明顯相關(guān)[8]。HBV的各種蛋白在肝纖維化進展過程中發(fā)揮著重要的作用，編碼病毒蛋白的病毒基因組不同區(qū)域與肝纖維化、肝細胞凋亡以及導(dǎo)致肝損傷的通路密切相關(guān)。

許多研究認為，炎癥因素在纖維化發(fā)生過程中發(fā)揮著重要的作用[1，5]。HBV與機體免疫系統(tǒng)的相互作用造成肝臟炎癥和細胞壞死，多種細胞釋放炎癥因子，激活HSC發(fā)生表型轉(zhuǎn)化，啟動肝纖維化過程[1]。動物實驗相關(guān)數(shù)據(jù)以及慢性HBV感染病人的臨床研究表明，炎癥相關(guān)的細胞因子在纖維化形成過程中發(fā)揮著重要的作用。炎癥相關(guān)細胞因子包括前炎癥細胞因子以及抗炎癥因子，其中前炎癥因子包括腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β），抗炎因子如白細胞介素 -10（interleukine-10，IL-10），編碼這些細胞因子基因的多態(tài)性與纖維化進展明顯相關(guān)。

免疫功能紊亂是急慢性肝損傷的主要原因，其中T細胞、B細胞、Kupffer細胞、自然殺傷細胞（natural killer cell，NK細胞）以及自然殺傷T細胞（natural killer T cell，NKT細胞）等免疫細胞在肝纖維化的免疫學(xué)發(fā)病機制中具有重要的作用[9]。研究表明，HBV轉(zhuǎn)基因小鼠的肝臟NKT細胞可以直接激活HSC，并且NKT細胞分泌的IL-4和IL-13在HSC活化過程中發(fā)揮著重要的作用[10]。在慢性乙型肝炎與肝硬化病人中，IL-17以及IL-17活化的單核細胞可以促進HSC的激活，從而促進疾病的進展；外周血以及肝內(nèi)輔助性T細胞17（T helper cell 17，Th17）的增加通過誘發(fā)HSC激活促進疾病進展[11]。在HBV相關(guān)的肝纖維化過程中，具有抗炎作用的調(diào)節(jié)性T細胞（Regulatory T cell，Treg細胞）與具有促炎作用的Th17細胞對肝損傷以及HSC的影響是相反的[12]。除此之外，補體是肝臟免疫調(diào)節(jié)過程中重要的免疫調(diào)節(jié)劑，在慢性肝臟疾病的發(fā)病機制中有重要的作用。在慢性乙肝病毒感染的病人中，補體C5a與表達C5a受體的HSC相作用可以促進纖維化的形成[13]。

上述研究表明，在慢性HBV感染過程中，HBV可以間接作用于HSC，其中宿主遺傳因素、HBV基因的變異對其有明顯的影響，肝臟炎癥以及免疫學(xué)等因素也發(fā)揮著重要的作用。

（二）HBV直接作用于HSC 在丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）的研究中發(fā)現(xiàn)，HCV的基因以及其蛋白成分對HSC具有一定的直接作用。在大鼠原代肝星狀細胞與穩(wěn)定表達HCV核心蛋白的 HepG2細胞系（HepG2-HCV core cell line）的體外共培養(yǎng)體系中發(fā)現(xiàn)，HCV核心蛋白可以促使HSC的狀態(tài)和數(shù)目發(fā)生改變，引起ECM的變化，加重炎性浸潤和損傷，促進肝纖維化進展[14]。該研究可以提示嗜肝病毒及其蛋白成分可能對HSC有直接影響。

乙型肝炎病毒是嗜肝DNA病毒，它選擇性的在肝細胞內(nèi)進行大量復(fù)制并釋放病毒顆粒和病毒蛋白等成分。HBV除通過損傷肝實質(zhì)間接引起肝纖維化，還可以通過直接作用于HSC而引起肝纖維化的發(fā)生。

Liu等[15]的研究發(fā)現(xiàn)，在體外的細胞共培養(yǎng)中，HBV與乙型肝炎病毒表面抗原（hepatitis B virus surface antigen，HB-sAg）可以影響人肝星狀細胞（LX-2細胞）的增殖，并且HBV可以短暫的感染LX-2細胞、在其中復(fù)制表達HBs以及乙型肝炎病毒核心蛋白（hepatitis B virus core protein，HBc），還可以顯著增加LX-2細胞Ⅰ型膠原信使RNA（mRNA）以及蛋白質(zhì)的表達。該研究中通過免疫電鏡技術(shù)觀察到，HBV可以感染LX-2細胞，但是HBV并不能在LX-2細胞中持久的復(fù)制以及合成包膜蛋白等物質(zhì)，可能因為肝星狀細胞并不是HBV最適宜的宿主細胞，認為HBV對LX-2細胞的作用不是通過感染實現(xiàn)的[15]。王宇等[16]的研究發(fā)現(xiàn)，在體外培養(yǎng)的LX-2細胞，只有少量細胞中可以檢測到HBV DNA，每個細胞中均在0.05拷貝以下，在所有LX-2細胞中未檢測到共價閉合環(huán)狀 DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA）；用Southern blot和Northern blot方法未檢測到LX-2細胞中存在HBV復(fù)制中間體及mRNA，此項研究中未發(fā)現(xiàn)HBV感染肝星狀細胞的證據(jù)。Wu等[17]的研究發(fā)現(xiàn)，HBV可以直接促進LX-2細胞TGF-β1及其下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的表達，HBV可以促進LX-2細胞Ⅰ型膠原的合成，且這一效應(yīng)主要通過P38MAPK途徑介導(dǎo)。這些結(jié)果表明，HBV雖不能感染肝星狀細胞，也不能在其中復(fù)制，但是可以通過直接作用于肝星狀細胞促進肝纖維化的發(fā)生。這為解釋臨床慢性HBV感染患者肝纖維化或肝硬化的發(fā)生與病毒滴度呈正相關(guān)提供了一定的實驗依據(jù)。但是該研究中所使用的是LX-2細胞，為活化的HSC細胞系，因此HBV對靜止期HSC的直接作用還不清楚，有待于建立HBV直接作用于HSC細胞的、更接近生理狀態(tài)的模型，進一步的闡明HBV對HSC的直接作用。

Bai等[18]的研究發(fā)現(xiàn)，HBV顆粒、c蛋白以及x蛋白（hepatitis B virus x protein，HBx）可以促進 LX-2細胞增殖，并且可以增加血小板源性生長因子-B（Platelet Derived Growth Factor-B，PDGF-B）、PDGF受體 -β（Platelet Derived Growth Factor Receptor-β，PDGFR-β）、Ⅰ型膠原以及α平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）mRNA的表達，并且PDGFR-β的磷酸化增加。但是PDGF-B、PDGFR-β蛋白水平?jīng)]有明顯改變。該研究表明HBV顆粒、c蛋白以及x蛋白在體外可以促進LX-2細胞增殖、促進纖維化形成，并且PDGF-B/PDGFR-β信號通路在此過程中發(fā)揮著重要的作用。

HBV的基因組包括四個開放讀碼框，可以編碼HBsAg、HBV核心蛋白、反轉(zhuǎn)錄DNA聚合酶以及HBx蛋白。但是在HBV促進肝纖維化的發(fā)生機制中，哪種成分可以導(dǎo)致HSC分裂增殖、肝臟膠原沉積尚不清楚[19]。

研究表明，HBx的生物學(xué)功能是多樣的，能夠通過調(diào)節(jié)許多信號通路改變細胞的功能。它在病毒復(fù)制以及肝細胞癌的發(fā)生過程中發(fā)揮著重要的作用，并且在肝纖維化形成過程中，表達HBx蛋白的肝細胞分泌TGF-β增加，進而導(dǎo)致HSC的激活以及細胞分裂增加[20]。

一項研究中，LX-2細胞與穩(wěn)定表達HBx蛋白的細胞系（QSG7701-HBx）的體外共培養(yǎng)模型中發(fā)現(xiàn)，HBx可以直接引起HSC增殖，并且上調(diào)纖維化相關(guān)分子的表達，例如α-SMA、TGF-β1、結(jié)締組織生長因子以及轉(zhuǎn)化生長因子β受體Ⅱ[19]。

包括HBx在內(nèi)的其它HBV蛋白在肝纖維化過程中的作用需要進一步的研究，以發(fā)現(xiàn)HBV是否可以直接作用于肝星狀細胞，并且發(fā)現(xiàn)是哪種HBV相關(guān)蛋白在其中發(fā)揮的作用。

Winau等[21]的研究認為，肝星狀細胞具有抗原提呈作用，提示HSC表面具有可以識別、捕獲抗原分子靶位的位點。因此認為HBV可能通過特異或非特異性粘附作用接觸LX-2細胞表面，從而刺激細胞發(fā)生功能改變，進而促進肝纖維化的發(fā)生。這也提示HBV可以直接作用于肝星狀細胞。

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