馬鈴薯龍葵素的研究進(jìn)展

李 美 ，熊興耀 ，2，胡新喜 ，2，劉明月 ，2

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.湖南省馬鈴薯工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙 410128）

馬鈴薯是一年生茄科植物，其塊莖營養(yǎng)價值高，富含淀粉、蛋白質(zhì)、糖類及多種維生素和無機(jī)鹽[1]。馬鈴薯是繼水稻、小麥、玉米之后的第四大糧食作物，種植面積在逐年增加，尤其是在發(fā)展中國家。據(jù)預(yù)測，到2030年我國人口達(dá)到16億，糧食總需求量為6.4億t[2]。因此，發(fā)展馬鈴薯產(chǎn)業(yè)，將在解決中國糧食問題上發(fā)揮重大作用。但是，馬鈴薯在貯藏過程中易變綠、發(fā)芽，抑制馬鈴薯發(fā)芽的氯苯胺等化學(xué)試劑具有毒副作用。研究表明，變綠的馬鈴薯和芽中含有龍葵素，而龍葵素多食可導(dǎo)致中毒，是不容忽視的農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全問題。為提高安全意識和科學(xué)解決這些問題，從龍葵素類、結(jié)構(gòu)、毒理及提取方法和檢測方法等方面對龍葵素進(jìn)行了綜述，為今后龍葵素的研究提供參考。

1 龍葵素的種類

龍葵素，是植物體內(nèi)所有糖苷生物堿的總稱（TGA），是植物為抵御動物、昆蟲和微生物等的侵害而合成的次生代謝產(chǎn)物，一般在植物的芽、嫩葉、花及未成熟的果實中含量比較高。糖苷生物堿是一種甾體皂苷，由疏水苷元（糖苷配基）和親水寡糖鏈組成，苷元部分由1個環(huán)戊烷多氫菲（非極性的甾體單元）和1個含氮雜環(huán)（氮核）連接而成。構(gòu)成寡糖鏈的單糖有葡萄糖、半乳糖、木糖、鼠李糖，苷元與單糖通過氧糖苷鍵連接（表1）。目前，已發(fā)現(xiàn)100多種糖苷生物堿，大多存在于茄科和百合科植物中[3]。

2 龍葵素的合成與代謝途徑

龍葵素在植物的根、莖、葉中都能合成，但關(guān)于其合成途徑的報道很少，其可能遵循如下合成途徑[4]：乙酰輔酶A→甲羥戊酸（MVA）→菠菜烯（角鯊烯）→環(huán)阿屯醇→膽固醇→茄啶。該合成途徑的關(guān)鍵化合物是乙酰輔酶A，細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和線粒體中都有乙酰輔酶A合成酶，細(xì)胞質(zhì)中的乙酰輔酶A合成酶直接活化進(jìn)入細(xì)胞的乙酸，形成線粒體外的乙酰輔酶A；從葡萄糖或者長鏈脂肪酸等分解產(chǎn)生的乙酰輔酶A是通過線粒體內(nèi)的乙酰輔酶A合成酶催化產(chǎn)生的。因此，乙酰輔酶A可能是來源于糖酵解的終產(chǎn)物丙酮酸的氧化。龍葵素的代謝主要通過根系分泌完成，植物殘株分解和種子萌發(fā)等為輔。

表1 馬鈴薯野生種和栽培種的糖苷生物堿

3 龍葵素的藥（毒）理

研究發(fā)現(xiàn)，龍葵素有抗腫瘤、強(qiáng)心健體、平喘鎮(zhèn)痛、保肝護(hù)肝、降壓抗炎及保護(hù)腎臟、胰臟等多種作用，但它也有很強(qiáng)的毒副作用，還可致畸、致突變[5]。番茄堿對30余種病原菌的有明顯的抗性，能抑制白色念球菌和皮膚蘚菌，殺死血吸蟲寄主釘螺；龍葵素中抗瘧作用依次為：a-卡茄堿>番茄堿>垂茄堿>a-茄堿。季宇彬等[6]研究表明，龍葵素對小鼠腫瘤細(xì)胞膜 K+，Na+，-ATPase 及 Mg2+，Ca2+，-ATPase有顯著的抑制作用，降低腫瘤細(xì)胞膜的通透性，使腫瘤細(xì)胞無法異常擴(kuò)增，顯著延長了小鼠的生存時間。梁前進(jìn)等[7]的研究進(jìn)一步驗證了此結(jié)果。

龍葵素的致毒機(jī)理是抑制膽堿酯酶活性從而引起中毒，龍葵素的含量與品種特性、收獲時間、受損程度、儲藏條件等密切相關(guān)[8]。a-茄堿可干擾受試雄性小鼠的生精功能，75 mmol/L的α-茄堿即可對睪丸細(xì)胞產(chǎn)生毒性，細(xì)胞毒性隨著α-茄堿濃度增加而增強(qiáng)[9]。龍葵素含量0～10 mg/100g FW在食用安全范圍內(nèi)；10～20 mg/100g FW食用時麻口，并帶有苦味；超過20 mg/100g FW食用后可能引起中毒，甚至死亡。因此，在生產(chǎn)中種植戶應(yīng)選擇龍葵素含量低的品種進(jìn)行栽培，并且在收獲時避免破損，采取合理的貯藏措施，消費(fèi)者則應(yīng)選擇沒發(fā)芽的馬鈴薯食用。

4 龍葵素的提取

4.1 龍葵素提取方法

龍葵素具有一定的光、熱穩(wěn)定性，目前廣泛使用的提取方法有浸提法、回流提取法、索氏抽提法、超聲波提取法和微波提取法5種（見表2）。

表2 龍葵素的提取方法

4.1.1 浸提法浸提法是最簡單、最原始的萃取方法。（1）用混合溶劑乙醇∶乙腈∶乙酸（5∶3∶2，V/V/V）浸提馬鈴薯鮮樣20 h，過濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，濃縮，離心，取上清液調(diào)pH，70℃保溫30 min，4℃靜置8 h，提取率在65%，重復(fù)性差[10]。（2）加5%乙酸攪拌浸提馬鈴薯樣品，過濾，用氨水調(diào)pH，用正丁醇萃取4次，將提取液蒸發(fā)至干，即得粗產(chǎn)品[11]。（3）用95%乙醇浸提黃果茄果實粗粉24 h，60℃旋轉(zhuǎn)濃縮，再用5%冰乙酸和1%氨水反復(fù)溶解、沉淀[12]。浸提法簡單易行且成本低，可是浸提時間很長且提取不完全。

4.1.2 回流提取法回流提取法利用高溫回流達(dá)到萃取的效果。（1）用鹽酸（2 mol/L）-乙醇在 65℃溫度下提取龍葵樣品，過濾，濃縮，殘渣用0.5 mol/L的鹽酸溶解，氯仿萃取3次，濾液調(diào)pH至10.5，氯仿萃取 3 次，旋轉(zhuǎn)蒸干；（2）用鹽酸（2mol/L）-乙醇溶解，在100℃條件下水解，蒸餾去除乙醇，用氯仿萃取3次，酸水層調(diào)pH值至10.5，氯仿萃取3次，合并氯仿萃取液，旋轉(zhuǎn)蒸干得到澳洲茄胺?；亓魈崛》ㄌ崛÷屎芨?，但是過程冗長、繁瑣，耗時長。

4.1.3 索氏抽提法索氏抽提法主要是利用回流和虹吸的原理反復(fù)回流萃取。用乙醇/乙酸混合液（10∶3，V/V）提取馬鈴薯鮮樣，用磁力攪拌器攪拌15 min，放入索式脂肪抽提器中，在溫度55～65℃條件下水浴抽提16 h，濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至浸膏狀，用5%的硫酸溶解，過濾，用氨水調(diào)節(jié)濾液pH值至11，離心，用1%氨水洗滌，干燥沉淀后即得粗產(chǎn)品[13]。索氏抽提法提取率比回流提取率高，過程也更加繁瑣，耗時更長，適宜提取熱穩(wěn)定性高的物質(zhì)。

4.1.4 超聲波提取法超聲波提取法利用超聲波在溶劑和樣品之前產(chǎn)生聲波空化作用，分散固體樣品，增大樣品與提取溶劑之間的接觸面積，加速目標(biāo)物從固體樣品轉(zhuǎn)移到提取溶劑中。（1）用70%甲醇超聲波提取茄子，旋轉(zhuǎn)濃縮，調(diào)pH值至2.5，冷凍離心，上清液用乙醚萃取后調(diào)pH值至10.5，冷凍離心，用0.25%HCl溶解沉淀，調(diào)pH值至10.5，離心，甲醇溶解沉淀，回收率為97.97%；（2）優(yōu)化超聲波提取方法：最佳提取料液比為1∶10，提取溶劑為70%甲醇，超聲溫度為50℃，超聲時間為60 min，回收率為98.0%[14]。超聲提取率高，回收率高，提取時間短，設(shè)備簡單，逐漸替代回流提取法和索氏提取法。

4.1.5 微波提取法微波提取法利用微波直接穿透非極性分子，被極性分子選擇性吸收的原理加熱樣品輔助提取。先用乙醇-冰乙酸微波輔助提取，然后索氏抽提16 h，過濾，濃縮，1%硫酸溶解，過濾。用濃氨水調(diào)節(jié)pH值10.5，4℃下靜置過夜，離心，沉淀用1%氨水沖洗至洗滌液澄清，取沉淀烘干即得粗產(chǎn)品。通過正交試驗得出最佳提取工藝：料液比為 10 g/200 mL，乙醇/冰乙酸 100∶10（V/V），在 540 W下提取6 min[15]。微波提取率高，提取過程復(fù)雜。目前利用微波提取的比較少，此方法還有待改進(jìn)。

4.2 龍葵素提取溶劑

龍葵素呈弱堿性，在酸性條件下溶解成鹽，在堿性溶液中產(chǎn)生沉淀析出，這就是常說的“酸溶堿沉”，通常使用弱酸和有機(jī)溶劑提取龍葵素,常用的提取溶劑見表3，因溶劑種類的不同，又可將提取方法分為單溶劑法、雙溶劑法和混合溶劑法。

表3 龍葵素的提取溶劑

5 龍葵素的檢測

龍葵素的檢測方法包括滴定法、比色法、酶聯(lián)免疫法、高效液相色譜法和液-質(zhì)聯(lián)用法等5種方法（表4）。

表4 龍葵素的檢測方法

5.1 滴定法

這是最早的檢測龍葵素的方法，利用甲醇/氯仿雙溶劑法進(jìn)行索氏抽提，得到的粗產(chǎn)品用無水甲醇溶解，用加了溴酚藍(lán)指示劑的10%苯酚甲醇溶液滴定[17]。該方法測定的是龍葵素的苷元部分，能定量所有的糖苷生物堿，使用的儀器和試劑成本低，檢測速度快，但是需要苷元標(biāo)準(zhǔn)品做標(biāo)準(zhǔn)曲線，且回收率低，可以進(jìn)行簡單快速的定性，不適合定量。

5.2 比色法

比色法是通過測量有色物質(zhì)顏色深度來確定待測組分含量的方法。儀器簡單、操作簡便、耗時短，但其精確度不高。比色法常用顯色劑有：甲醛/濃硫酸（Marquis試劑）、1%多聚甲醛/85%磷酸（Clarke試劑）、三氯化銻/濃鹽酸和溴百里酚蘭。影響比色法定量精確性的因素有：水相pH值、染料本身、有機(jī)溶劑、共存物等。比色法設(shè)備簡單、成本低，在龍葵素研究初期使用比較多。

5.3 酶聯(lián)免疫法（ELISA法）

酶聯(lián)免疫法是一種免疫測定技術(shù)，在有抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記的基礎(chǔ)上，讓抗體與酶復(fù)合物結(jié)合，底物被酶催化生成有色物質(zhì)，產(chǎn)物的量與待測物質(zhì)的量直接相關(guān)。用有96個微孔板的培養(yǎng)箱，在每個孔的表面固定化抗原，酶標(biāo)記抗原或抗體，再測定抗原或抗體的濃度，Morgan MRA等將龍葵素抗血清分別稀釋1/20 000和1/3 000，將α-卡茄堿標(biāo)準(zhǔn)品添加到馬鈴薯勻漿中，測得的回收率是93%。

5.4 高效液相色譜法（HPLC法）

高效液相色譜法是以液體作為流動相的色譜分離方法，是利用待測物在兩相之間分配系數(shù)不同而進(jìn)行分離的技術(shù)。用四氫呋喃∶水∶乙腈∶乙酸（50∶50∶20∶1，V/V/V/V）混合溶劑提取勻漿后的馬鈴薯鮮樣過濾，濾液離心，上清液加醋酸，超聲振蕩5 min，氨水調(diào)pH值至10.5，濃縮，調(diào)pH值，離心，蒸干沉淀，用2 mL硫酸溶解，過0.45μm的膜，以乙腈/磷酸二氫鉀（75∶25，V/V）為流動相，用 YWG-C18 不銹鋼柱為色譜柱，流速為0.7 mL/min，檢測波長為208 nm，進(jìn)樣10μL，進(jìn)行高效液相色譜檢測，回收率為91.5%，變異系數(shù)為3.84%[19]。HPLC法目前被廣泛采用，其分離純度高，分離效果很明顯。

5.5 液-質(zhì)聯(lián)用法（LC-MS法）

液-質(zhì)聯(lián)用法是一種先通過液相色譜分離得到目標(biāo)成分，再經(jīng)過質(zhì)譜將物質(zhì)離子化，按照離子的質(zhì)荷比分離，從而測量目標(biāo)離子的離子譜峰的強(qiáng)度的分析方法。用液-質(zhì)聯(lián)用法可以檢測到微量的龍葵素，比如 α-solanine（m/z，868）檢測限為 3.8×10-7μg/L，α-chaconine（m/z，852）檢測限為 1.4×10-8μg/L[20]。液-質(zhì)聯(lián)用法是在高效液相色譜法的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，其靈敏度比高效液相色譜法高，適合測定龍葵素含量比較低的樣品。

由于一般情況下馬鈴薯塊莖中龍葵素含量比較低，應(yīng)選用精確的檢測方法，因此目前最常用檢測方法是高效液相色譜法和液-質(zhì)聯(lián)用法。

6 展望

龍葵素在植物抵御病蟲害、抑制真菌、調(diào)節(jié)種群結(jié)構(gòu)以及維系種群間協(xié)同進(jìn)化等方面發(fā)揮著重要作用，且龍葵素具有保健藥用價值。隨著分子生物學(xué)和分析化學(xué)的發(fā)展，龍葵素研究重點(diǎn)將在龍葵素結(jié)構(gòu)組成、合成與代謝機(jī)理、在植物防御中的作用機(jī)制、藥理與毒理以及低龍葵素含量新品種選育等方面，并預(yù)期可取得重要研究進(jìn)展。

[1]熊興耀，劉明月，何長征.馬鈴薯生產(chǎn)實用技術(shù)[M].湖南科學(xué)技術(shù)出版社，2004.

[2]中華人民共和國國務(wù)院新聞辦公室.中國的糧食問題[N].人民日報，1996-10-8（1）.

[3]Lachman J,Hamouz K,Orsak M,et al.Potato glycoalkaloids and their significance in plant protection and human nutrition-review[J].Rostlinna Vyroba-UZPI,2001,4（47）:181-191.

[4]Idit Ginzberg·Jamed G.Tokuhisa·Richard E.Veilleux.Potato Steroidal Glycoalkaloids:Biosynthesis and Genetic Manipulation[J].Potato Research,2009,（52）:1-15.

[5]Crawford L,Myhr B.A preliminary assessment of the toxic and mutagenic potential of steroidal alkaloids in transgenic mice.[J].Food Chem Toxicol,1995,33（3）:191-194

[6]季宇彬，王宏亮，高世勇.龍葵堿對荷瘤小鼠腫瘤細(xì)胞膜唾液酸含量和封閉度的影響[J].中草藥，2005，369（1）：79-81.

[7]梁前進(jìn)，李翠妮，向 俊，等.北京外來入侵植物刺萼龍葵抑腫瘤 ATPase效應(yīng)評估[J].中國生物工程雜志，2010，309（12）：36-41.

[8]黃紅蘋，郭華春，王 瓊，等.云南馬鈴薯品種（系）塊莖中的龍葵素含量測定[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，449（7）：1512-1518.

[9]王秋平，郎 朗，季宇彬.龍葵堿對雄性小鼠睪丸毒性的初步研究[J].食品與藥品，2009，119（11）：10-13.

[10]張 薇，熊興耀，李 霞.馬鈴薯中龍葵素的提取方法[J].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2006,12（32）：665-667.

[11]Sotelo A,Serrano B.High-performance liquid chromatographic determination of the glycoalkaloids a-solanine and a-chaconine in 12 commercial varieties of Mexican potato[J].J.Agric.Food Chem.,2009,（48）:2472-2475.

[12]李 洲，程 溪，王春靜，等.黃果茄殺滅釘螺有效成分的分離提純及其效果觀察[J].中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜質(zhì)，2005，23（4）：206-208.

[13]蔣新宇，楊 輝，趙 宇.龍葵中甾體類生物總堿的含量測定[J].食品科學(xué)，2006，27（8）：224-227.

[14]周寶利，李志文，丁昱文，等.茄子果實中α-茄堿提取方法的研究[J].園藝學(xué)報，2009，36（1）：141-146.

[15]張 薇，文 雄，潘雙銀，等.微波輔助提取馬鈴薯龍葵素[J].園藝學(xué)報，2008，35（9）：1393-1396.

[16]Angela Sotelo,Beatriz Serrano.High-performance liquid chromatographic determination of the glycoalkaloids a-solanine and a-chaconine in 12 commercial varieties of Mexican potato[J].J.Agric.Food Chem.,2009,（48）:2472-2475.

[17]季彥林，王旺田，王 蒂，等.不同光質(zhì)對馬鈴薯塊莖糖苷生物堿積累的誘導(dǎo)[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，2010，26（1）：40-45.

[18]Haddadin M SY,Humeid M A,Qaroot F A,et al.Effect of expo－sure to light on the solanine content of twovarieties of potato （Solamum tuberosum）popular in Jordan[J].Food Chemistry,2009,（73）:205-208.

[19]王守蘭，朱 佳.高效液相色譜法測定馬鈴薯中a-茄堿含量[J].食品科學(xué)，1999，（6）：60-61.

[20]Distl M,Wink M.Indentification and quantification of steroidal alkaloidsfrom wild tuber-bearing solanum species by HPLC and LC-ESI-MS[J].Potato Research,2009,（52）:79-104.