T-2毒素研究進(jìn)展

劉 磊，張國(guó)巍，丁 博，王會(huì)巖 (吉林醫(yī)藥學(xué)院檢驗(yàn)學(xué)院，吉林 吉林 132013)

T-2毒素是由鐮刀菌在特定條件下產(chǎn)生的單端孢霉烯族毒素，廣泛分布于自然界，是污染田間作物和庫(kù)存谷物的主要毒素，1968年bamburg首次分離提純得到T-2毒素結(jié)晶，并確定化學(xué)結(jié)構(gòu)。1973年聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)業(yè)組織(FAQ)和世界衛(wèi)生組織(WHO)在日內(nèi)瓦召開(kāi)的聯(lián)席會(huì)議上，已將這類(lèi)毒素同黃曲霉毒素一樣列為天然存在的最危險(xiǎn)的食品污染源。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)人類(lèi)食管癌、地方性腎病、食物中毒性白細(xì)胞缺乏病(ATA)、克山病和大骨節(jié)病的病因可能與單端孢霉烯族毒素的污染密切相關(guān)［1-3］。自此有關(guān)T-2毒素對(duì)人類(lèi)健康的危害引起了各國(guó)科學(xué)家的關(guān)注。近幾年，國(guó)內(nèi)圍繞T-2毒素進(jìn)行了大量的研究工作，取得了很大進(jìn)展。本文就T-2毒素的產(chǎn)生、理化性質(zhì)、檢測(cè)方法及毒性作用等方面進(jìn)行綜述。

1 產(chǎn)毒菌株

T-2毒素主要來(lái)自鐮刀菌屬，如三線鐮刀菌(F.tricinctum)、擬枝孢鐮刀菌(F.sporotrichioides)、梨孢鐮刀菌(F.poae)、尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)、串珠鐮刀菌(F.moniliforme)等均能產(chǎn)生T-2毒素。其產(chǎn)毒能力受菌屬種類(lèi)、溫度、濕度、pH、蛋白、糖和光照等因素的影響［4］。Burmeister和Wyatt等［5-6］研究三線鐮孢菌，于15℃培養(yǎng)3周，可獲得大量的T-2毒素?？镩_(kāi)源等［7］研究三線鐮刀菌M-20在5～15℃下，培養(yǎng)四周產(chǎn)毒能力最強(qiáng)。Rukhyada VV等［8］研究擬枝孢鐮刀菌在濕度40%～50%，溫度3～7℃條件下，玉米和黑麥中產(chǎn)毒能力最強(qiáng)。代喆等［9］研究梨孢鐮孢菌在液體培養(yǎng)中產(chǎn)毒，最佳條件為8～25℃間隔12 h變溫、前期光照后期黑暗、前期振蕩后期靜止培養(yǎng)28 d，可獲得一定量的T-2毒素。

2 理化性質(zhì)

T-2毒素是一種倍半萜烯化合物，化學(xué)名為4β-15-二乙酰氧基-3α-羥基-8α-(3-甲基丁酰氧)-12，13-環(huán)氧單端孢霉-9-烯，分子式為C24H34O9，相對(duì)分子質(zhì)量為466.22。純品為白色針狀晶體，難溶于水，易溶于甲醇、無(wú)水乙醇、乙酸乙酯、丙酮等極性有機(jī)溶劑，性質(zhì)穩(wěn)定，在室溫下放置6～7年或加熱至100～120℃1～2 h，毒性不會(huì)減弱，而在堿性條件下可失去毒性。T-2毒素幾乎對(duì)所有的真核生物，包括植物、動(dòng)物及人類(lèi)均具有一定的毒性［10-11］，Baltriukiene等［12］研究表明其毒性與結(jié)構(gòu)中的環(huán)氧基團(tuán)和雙鍵有關(guān)。

3 分析檢測(cè)方法

關(guān)于T-2毒素的檢測(cè)方法有很多，隨著檢測(cè)技術(shù)的不斷發(fā)展，目前應(yīng)用比較廣泛的測(cè)定方法有氣相色譜(GC)、液相色譜(HPLC)、氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)、液質(zhì)聯(lián)用(LC-mass spectrometry，LC-MS)和免疫法。其中，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)由于不需要針對(duì)T-2毒素進(jìn)行衍生化處理，且有較高的靈敏度和特異性，目前已成為包括T-2毒素在內(nèi)的單端孢霉烯族真菌毒素的最為廣泛的分析檢測(cè)方法。

3.1 氣相色譜法

氣相色譜法具有高靈敏度、高分離效能、高選擇性等優(yōu)點(diǎn)。氣相色譜儀可與電子捕獲檢測(cè)器(Electron capture detection，ECD)、火焰離子化檢測(cè)器(Flame ionization detection，F(xiàn)ID)等是目前分析檢測(cè)單端孢霉烯族毒素最廣泛的方法。T-2毒素自身并不具揮發(fā)性，因此，使用GC檢測(cè)時(shí)，一般需要以硅烷化或氟?；噭┻M(jìn)行衍生化處理。Valle-Algarra等［13］采用GC-ECD方法對(duì)辣椒中T-2毒素進(jìn)行分析檢測(cè)，最低檢測(cè)限為7μg/kg，回收率為71.1%。Kong等［14］建立了靈敏度高的GC-ECD檢測(cè)方法，檢測(cè)中藥中的T-2、HT-2毒素，樣品經(jīng)七氟丁酰咪唑衍生化后檢測(cè)，最低檢測(cè)限為1.88μg/kg，回收率為89.2%～99.1%。Eke等［15］建立GC-FID方法檢測(cè)粗麥粉和粗玉米粉中T-2毒素，以雙三甲基硅基三氟乙酰胺(BSTFA)為衍生化試劑，其最低檢測(cè)限分別為0.3μg/kg和0.47μg/kg。

3.2 高效液相色譜法

由于T-2等A型單端孢霉烯族毒素沒(méi)有紫外吸收，要采用HPLC法進(jìn)行測(cè)定，必須通過(guò)柱前或柱后衍生化處理才能進(jìn)行檢測(cè)。目前，比較常用的是通過(guò)柱前衍生化為其加上熒光基團(tuán)，再采用高靈敏度的熒光檢測(cè)法進(jìn)行測(cè)定，該方法被廣泛使用。Jimenez等［16］以coumarin-3-carbonyl chloride為衍生化試劑，對(duì)衍生化條件進(jìn)行了考察優(yōu)化，并對(duì)3種不同的凈化方法(硅膠柱、C18SPE柱和液液萃取法)進(jìn)行了考察，最后確定液液萃取為最佳的凈化方法。該方法對(duì)T-2毒素的最低檢測(cè)限為10 ng/g。Schothorst等［17］將T-2毒素衍生化后，進(jìn)行LC-熒光法檢測(cè)，其最低檢測(cè)限為0.6μg/kg。Lippolis等［18］對(duì)3種熒光標(biāo)記試劑［1-naphthoyl chloride(l-NC)，2-naphthoyl chloride(2-NC)和pyrene-1-carbonyl cyanide(PCC)］進(jìn)行了比較，結(jié)果表明采用2-NC和PCC作為熒光試劑靈敏度和選擇性更好，對(duì)T-2毒素的最低檢測(cè)限分別為6.3 ng/kg和2.0 ng/kg。

3.3 色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)

色譜聯(lián)用技術(shù)主要是使用合適的接口技術(shù)將氣相色譜儀、高效液相色譜儀與質(zhì)譜儀等聯(lián)結(jié)起來(lái)，從而可以達(dá)到同時(shí)進(jìn)行定性和定量檢測(cè)，對(duì)于初級(jí)監(jiān)測(cè)呈陽(yáng)性反應(yīng)的樣品進(jìn)行在線確證，有很大的優(yōu)勢(shì)。其中液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC-mass spectrometry，LC-MS)由于不需要針對(duì)T-2毒素進(jìn)行衍生化處理，且有較高的靈敏度和特異性，目前已成為包括T-2毒素在內(nèi)的單端孢霉烯族真菌毒素的最為廣泛的分析檢測(cè)方法。S?rensen等［19］采用LC-MS/MS法分析了牛奶中的T-2毒素，采用正離子模式檢測(cè)，其最低檢測(cè)限為0.4μg/L，回收率為92%～101%。De Baere等［20］使用LC-MS/MS法，對(duì)豬和火雞的血漿、膽汁中的T-2毒素進(jìn)行定量分析，最低檢測(cè)限分別為0.01μg/L和0.06μg/L。LC-三重四級(jí)桿-線性離子阱質(zhì)譜［LC-hybrid triple quadrupole-linear ion trap MS(LC-QTrap/MS)］具有較高的靈敏度及同時(shí)定量定性分析的優(yōu)點(diǎn)，是一種較好的單端孢霉烯族真菌毒素分析方法。Rubert等［21］應(yīng)用該法，對(duì)27份志愿者的尿液進(jìn)行了11種真菌毒素的分析檢測(cè)，T-2毒素的最低檢測(cè)限為2μg/L。

3.4 免疫法

酶聯(lián)免疫吸附分析法(Enzyme linked adsorption immunoassay，ELISA)與GC、HPLC法等相比，具有樣品前處理簡(jiǎn)單、快速方便、特異性和靈敏度高且不需要昂貴的儀器設(shè)備及可以現(xiàn)場(chǎng)在線檢測(cè)等特點(diǎn)，比較適合推廣普及。T-2毒素分子量較小，本身無(wú)免疫原性，只有其與載體蛋白結(jié)合之后，才具有免疫原性。曹艷紅等［22］在自制T-2毒素酶標(biāo)半抗原的基礎(chǔ)上，結(jié)合市售抗T-2毒素單克隆抗體，建立了檢測(cè)谷物中T-2毒素的直接競(jìng)爭(zhēng)性酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法，該方法最低檢出限為0.125 ng/mL。Wang等［23］建立了直接競(jìng)爭(zhēng)免疫芯片法，對(duì)飲料中6種毒素進(jìn)行定量檢測(cè)，目視范圍內(nèi)可達(dá)到半定量檢測(cè)。其中T-2毒素的最低檢出限為0.05μg/L。但是，該方法仍存在一些缺點(diǎn)，如抗體制備復(fù)雜，交叉反應(yīng)及非特異性反應(yīng)干擾嚴(yán)重，從而導(dǎo)致假陽(yáng)性概率較高。

4 T-2毒素的毒性研究

T-2毒素是單端孢霉烯族化合物中毒性最強(qiáng)的一種，可通過(guò)多種途徑對(duì)人和動(dòng)物的多種組織和器官產(chǎn)生毒害作用，它主要作用于細(xì)胞分裂旺盛的組織器官。研究表明，T-2毒素能夠引起的毒性效應(yīng)包括消化系統(tǒng)和肝臟毒性、骨系統(tǒng)損傷、基因與細(xì)胞毒性、血液系統(tǒng)毒性、免疫系統(tǒng)毒性、神經(jīng)毒性和生殖發(fā)育毒性等。

4.1 消化系統(tǒng)和肝臟毒性

T-2毒素進(jìn)入動(dòng)物消化道，破壞消化道黏膜的完整性，影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，同時(shí)，家禽的口腔、胃、腸道也可見(jiàn)壞死性病變［24］。T-2毒素在體內(nèi)的重要損害部位之一是肝臟。抑制肝細(xì)胞蛋白質(zhì)合成和酶類(lèi)物質(zhì)的活性，降低肝臟對(duì)有毒物質(zhì)的代謝作用，誘導(dǎo)肝臟脂質(zhì)過(guò)氧化，損傷膜的結(jié)構(gòu)和功能，使肝細(xì)胞凋亡［25］。兔子和大鼠口服一定劑量的T-2毒素后，肝臟谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(GSTs)和微粒體細(xì)胞色素P450酶的表達(dá)與活性下降，同時(shí)大鼠肝臟脂質(zhì)過(guò)氧化水平和抗氧化酶活性增強(qiáng)［26-27］。

4.2 骨系統(tǒng)損傷

T-2毒素可引起動(dòng)物骨發(fā)育不良，骨質(zhì)減少，影響軟骨內(nèi)和骨膜內(nèi)骨化，以及骨相關(guān)肌肉和神經(jīng)系統(tǒng)的紊亂等。T-2毒素作用懷孕第9天的大鼠可引起胎兒肋骨與脊椎骨畸形［28］。T-2毒素還可以誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞IL-lβ與IL-6分泌，8μg T-2毒素通過(guò)誘導(dǎo)ILlβ與IL-6影響軟骨細(xì)胞發(fā)育，引起軟骨細(xì)胞凋亡［29］。T-2毒素能明顯增加軟骨細(xì)胞一氧化氮合酶蛋白表達(dá)，表達(dá)量與T-2毒素的濃度成正比，表明T-2毒素引起的軟骨細(xì)胞損傷與合成一氧化氮增多有關(guān)［30］。

4.3 基因與細(xì)胞毒性

T-2毒素抑制細(xì)胞蛋白質(zhì)、DNA和RNA合成，引發(fā)細(xì)胞氧化應(yīng)激導(dǎo)致DNA損傷，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、基因表達(dá)變化和細(xì)胞膜功能損傷等。絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族中的絲裂原活化蛋白激酶(P38)或c-Jun氨基末端激酶(JNK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被激活從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成受抑制［31-32］。細(xì)胞氧化過(guò)程中活性氧(ROS)的過(guò)量生成可引起機(jī)體的氧化應(yīng)激反應(yīng)。不能及時(shí)清除的ROS作用于DNA可導(dǎo)致DNA氧化損傷。T-2毒素還可以通過(guò)調(diào)節(jié)與凋亡相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Albarenque等［33］研究T-2毒素致大鼠皮膚以及體外培養(yǎng)角質(zhì)形成細(xì)胞原代細(xì)胞的試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞中與氧化應(yīng)激、凋亡相關(guān)的原癌基因c-fos、c-jun的表達(dá)量增加，從而激活相應(yīng)的信號(hào)通路引起凋亡。

4.4 血液系統(tǒng)毒性

T-2毒素可引起血小板和白細(xì)胞減少，傷口凝血能力減弱、抗感染能力下降，血細(xì)胞凋亡和骨髓壞死，嚴(yán)重時(shí)還可導(dǎo)致敗血病。此外，T-2毒素還與ATA有關(guān)。Bennett等［34］曾報(bào)道二戰(zhàn)期間士兵食用了T-2毒素污染的食物后患上致命的食物中毒性白細(xì)胞缺乏癥。T-2毒素可毒害定向造血干細(xì)胞，比如粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和紅細(xì)胞集落形成細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)T-2毒素是通過(guò)調(diào)節(jié)磷脂代謝(如促進(jìn)磷脂酶水解血小板膜磷脂)來(lái)抑制血小板的聚集作用［35］。另外，T-2毒素還可通過(guò)抑制凝血因子Ⅶ活性和依賴(lài)凝血酶原的纖維蛋白原活化過(guò)程導(dǎo)致家禽產(chǎn)生凝血?。?6］。

4.5 免疫系統(tǒng)毒性

低劑量的T-2毒素具有免疫刺激作用，引起血清中IgA和IgE抗體水平增加，從而增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能。高劑量情況下，白細(xì)胞減少，骨髓、淋巴結(jié)、脾臟和胸腺等免疫器官與組織受到損傷，從而導(dǎo)致機(jī)體免疫功能下降［37］。T-2毒素可能通過(guò)影響細(xì)胞因子來(lái)調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能。Meissonnier等［38］研究T-2毒素亞急性暴露實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞因子IL-2、IL-4、IFN-γ均未發(fā)生變化。由于免疫系統(tǒng)本身的復(fù)雜性，即使實(shí)驗(yàn)條件類(lèi)似，所得到的T-2毒素免疫毒性結(jié)果也不完全一致。因此，T-2毒素對(duì)動(dòng)物免疫系統(tǒng)毒效應(yīng)的復(fù)雜過(guò)程還有待我們進(jìn)一步深入研究。

4.6 神經(jīng)毒性

T-2毒素可損害血腦屏障，影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)，發(fā)揮神經(jīng)毒作用。注射T-2毒素后，端腦區(qū)神經(jīng)母細(xì)胞的凋亡數(shù)目明顯增多。通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR發(fā)現(xiàn)，T-2毒素主要是通過(guò)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，然后通過(guò)促分裂原活化蛋白激酶路徑誘導(dǎo)腦細(xì)胞的凋亡［39］。1.5 mg/kg和6 mg/kg的T-2毒素急性暴露SD大鼠，可導(dǎo)致其大腦皮層與紋狀體RNA耗竭和大腦皮層的神經(jīng)元蛋白水平下降［40］。T-2毒素還可通過(guò)改變血腦屏障通透性、抑制蛋白合成和降低單胺氧化酶活性引發(fā)小鼠神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)失衡［41］。此外T-2毒素可誘導(dǎo)大腦中神經(jīng)小分子變化和血清素活性變化，致使動(dòng)物食欲下降和肌肉協(xié)調(diào)產(chǎn)生問(wèn)題［42］。

4.7 生殖發(fā)育毒性

早期研究認(rèn)為T(mén)-2毒素對(duì)胚胎的毒性是繼母體毒性之后發(fā)生，而Ishigami等［43］用3 mg/kg的T-2毒素暴露受孕小鼠卻發(fā)現(xiàn)T-2毒素對(duì)胎鼠組織產(chǎn)生直接的細(xì)胞毒性，造成中樞神經(jīng)和骨骼系統(tǒng)細(xì)胞凋亡。一般認(rèn)為，T-2毒素誘導(dǎo)具有高增殖活性的細(xì)胞凋亡，但I(xiàn)shigami等［44］在增殖細(xì)胞核抗原陽(yáng)性細(xì)胞測(cè)試結(jié)果為陰性的區(qū)域發(fā)現(xiàn)了凋亡細(xì)胞，說(shuō)明T-2毒素對(duì)胎鼠的細(xì)胞毒性還受其他因素的影響。

5 研究展望

目前，T-2毒素在全球范圍內(nèi)已經(jīng)廣泛分布，范圍已覆蓋全球。歐洲、美洲、亞洲，連續(xù)出現(xiàn)T-2毒素的中毒現(xiàn)象，對(duì)人類(lèi)和動(dòng)物健康的潛在危害已不容忽視，已經(jīng)引起了全球各國(guó)的高度關(guān)注。因此，在掌握了解T-2毒素的產(chǎn)生、理化性質(zhì)、檢測(cè)技術(shù)的基礎(chǔ)上，選擇快速有效的檢測(cè)方法，全面開(kāi)展T-2毒素污染的生態(tài)安全性評(píng)價(jià)迫在眉睫。另外通過(guò)研究T-2毒素的毒性作用，特別是能夠引起細(xì)胞的凋亡，給我們提供了一個(gè)新的科研思路。

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