莽草酸含量測(cè)定研究進(jìn)展

白朝輝，石曉峰，劉東彥，李爽

莽草酸又稱毒八角酸，化學(xué)名為3,4,5-三羥基-1-環(huán)己烯-1-羧酸(3,4,5- trihydroxy-l-cyclohexene-1-carboxylic acid)，分子式C7H10O5，分子量174.15，廣泛存在于木蘭科八角茴香、松柏科等高等植物和微生物中，是一種重要的天然有機(jī)酸[1]。

莽草酸具有抗腫瘤、抗菌、抗艾滋病、鎮(zhèn)痛、抗血栓形成和抗腦缺血等多種藥理活性[2~5]，合成抗禽流感、抗甲流感唯一藥物-磷酸奧司他韋的重要原料[6]。本文對(duì)莽草酸含量測(cè)定方法的研究進(jìn)展綜述如下，希冀為莽草酸的開發(fā)利用和深入研究提供參考。

目前，莽草酸的含量測(cè)定主要集中在高效液相色譜(HPLC)及其聯(lián)用技術(shù)、氣相色譜法(GC)，紫外分光光度法(UV)，毛細(xì)管電泳法(CE)，偏最小二乘法-近紅外光譜法(PLS-NIR)等，其中高效液相色譜及其聯(lián)用技術(shù)是莽草酸含量測(cè)定的主要方法。

1 高效液相色譜及其聯(lián)用技術(shù)

1.1 高效液相色譜法

Lydon[7]采用HPLC測(cè)定莽草酸的含量，具體操作為樣品用超聲提取，色譜柱為Kromasil C18（250mm×4.6mm，5μm），流動(dòng)相為乙腈-1%冰醋酸水溶液，流速為0.8mL/min，柱溫為30℃，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為213 nm。莽草酸質(zhì)量濃度在0.57~7.36 μg/mL范圍內(nèi)，質(zhì)量濃度與峰面積有良好的線性關(guān)系（r=0.9996），保留時(shí)間為8分鐘，平均加樣回收率為99.36%，RSD%為1.71%（n=6）。Andreia PO等[8]建立HPLC測(cè)定榅桲屬植物葉中莽草酸的含量，儀器為Gilson-HPLC，色譜柱為Chromabond，流動(dòng)相：0.01N 硫酸，檢測(cè)器UV，波長(zhǎng)214 nm。王琳等[9]采用HPLC法測(cè)定不同采收期云南松中莽草酸的含量，色譜柱Agilent Eclipse XDBC18(46mm×50mm,5μm)，流動(dòng)相為甲醇-1%磷酸水溶液(10:90)，流速0.8mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)214nm，柱溫25℃。結(jié)果莽草酸在0.0312~0.4368μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系(r=0.9999)，平均加樣回收率為99.97%，RSD為1.06%(n=6)。林於等[10]采用HPLC法測(cè)定莽草酸的含量，莽草酸濃度在5~300μg/mL范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好(r=0.9993)，平均回收率為94.5%，RSD為2.5%(n=5)。此模型簡(jiǎn)單可靠，穩(wěn)定性好、精度高，在中藥有效成分定量分析中有廣闊的應(yīng)用前景。

1.2 反相高效液相色譜法

吳俊珠等[11]建立RP-HPLC測(cè)定松齡血脈康膠囊中莽草酸的含量，檢測(cè)波長(zhǎng)214nm，流速0.8mL﹒min-1，柱溫25℃。莽草酸進(jìn)樣量0.4～8.0μg呈良好的線性關(guān)系，r=0.9998，平均回收率為98.87%。郭亞健[12]建立RP-HPLC測(cè)定八角茴香不同部位中莽草酸的含量測(cè)定方法。平均回收率為101.27%，RSD為103%(n= 6)，顯示此方法可用于八角茴香莽草酸的含量測(cè)定。李偉[13]采用RP-HPLC對(duì)廣西不同產(chǎn)地的27個(gè)八角茴香樣品進(jìn)行莽草酸的含量測(cè)定，莽草酸含量在6.3%～7.6%，平均6.61%。試驗(yàn)對(duì)八角茴香中莽草酸的生產(chǎn)提供理論參考。反相高效液相色譜法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)、重復(fù)性好。

1.3 液相-氣相色譜聯(lián)用法

Magdolna[14]采用氣相液相色譜聯(lián)用測(cè)定莽草酸的含量，儀器條件：FID檢測(cè)器，15%DexsilGC300涂布，運(yùn)行時(shí)間30min，氮?dú)饬魉?0cm3/min。樣品在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干，再用無水鹽酸羥胺的吡啶處理，加熱溶解，冷卻后用六甲基二硅氮烷和三氟醋酸在反應(yīng)瓶中100℃反應(yīng)60min。莽草酸保留時(shí)間16min，最低檢測(cè)限1μg。開發(fā)了三甲基硅衍生物的單個(gè)解決方案，建立了有機(jī)酸和糖最佳條件的定量評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示在0.25~1μg，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD≥10.7%，莽草酸保留時(shí)間為16分鐘，最低檢測(cè)線為1微克，此法簡(jiǎn)單快捷。Bharathi A等[15]用LC-UV定量測(cè)定九種八角和各種其他種植物莽草酸的含量。LC-UV分離是通過反相色譜法在C18柱，磷酸二氫鉀和甲醇作為流動(dòng)相。該方法操作簡(jiǎn)單，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，回收率、精密度、重復(fù)性均符合要求。

1.4 高效液相色譜-質(zhì)譜法

Bharathi A等[15]采用高效液相色譜和串聯(lián)電噴霧質(zhì)譜，定量測(cè)定八角甲醇提取物莽草酸的含量。分離是通過反相色譜法在Agilentzorbax C18(150mm×4.6mm，5μm)柱，用含有0.1%乙酸的水和乙腈作為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為210nm，柱溫35℃，流速0.8mL/min。莽草酸在3～70μg﹒ml-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，回收率為98.66%，RSD=2.46%。這種方法被成功地用于研究九種八角和各種其他種植物莽草酸的含量。建立了LC-MS檢測(cè)莽草酸的定性和定量分析方法。本法簡(jiǎn)便，快速，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好。

1.5 離子抑制反相高效液相色譜

周光明[16]采用IS-RP-HPLC法對(duì)杉科植物中莽草酸進(jìn)行定性、定量分析。色譜柱：Hypersil ODS25mm(4.6mm×150mm)；流動(dòng)相：HClO4, 流速0.8 mL/min，pH為2.5，檢測(cè)波長(zhǎng)：214nm, 柱溫25℃，流速：0.8mL/min；在選定色譜條件下線性范圍良好，回收率102.6%，RSD=1.3%，r=0.9998。

2 氣相色譜法

Hong-cheng Liu等[17]，建立了氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定莽草酸含量。其分別采用超聲波提取和索氏提取法，提取物經(jīng)乙醚萃取，無水硫酸鈉脫水后揮去溶劑。測(cè)定方法及條件：以苯甲酸為內(nèi)標(biāo)，柱溫為起始溫度80℃，以5℃/min的速率升至210℃；檢測(cè)器溫度均為240 ℃；進(jìn)樣量1μL，對(duì)中國(guó)云南省不同產(chǎn)區(qū)的八角茴香進(jìn)行定量檢測(cè)，而且用方差分析評(píng)價(jià)了樣品的同質(zhì)性。結(jié)果表明超聲提取效率比索氏提取更快更簡(jiǎn)單，線性和回收率良好。屏邊縣和富寧縣莽草酸的含量最高。此模型穩(wěn)定性好、精度高，在中藥有效成分定量分析中有廣闊的應(yīng)用前景。該法簡(jiǎn)單、重現(xiàn)性好，可作為莽草酸的含量測(cè)定方法。

3 紫外分光光度法(UV)

分光光度法為報(bào)道中最早測(cè)定莽草酸定量的方法。張志信等[18]采用紫外分光光度法，測(cè)定八角茴香中莽草酸的含量，其操作是取八角茴香粉末超聲提取，檢測(cè)波長(zhǎng)213nm。結(jié)果武定、西疇、馬關(guān)產(chǎn)的野生和富寧種植八角茴香的莽草酸含量分別為135.05 mg/g、126.32和121.51mg/g、110.46mg/g(干重)。平均加樣回收率為102.25%，RSD為2.576%。證明八角茴香是提取莽草酸的良好原料。粟本超等[19]采用紫外分光光度法，樣品溶液用0.2%H3PO4稀釋，在213nm 波長(zhǎng)處測(cè)定莽草酸含量。結(jié)果其標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍是4.7～23.0μg/ml，平均回收率為97.25%，RSD=1.07%，n=5。表明紫外分光光度法與高效液相色譜法均可用于莽草酸的含量測(cè)定。Saslaw等[20]對(duì)濃度0.7～17μg/ml的莽草酸溶液進(jìn)行研究，用分光光度計(jì)于660nm的最大吸收處測(cè)定吸光度。Teresa[21]將體積為3倍莽草酸的96%硫酸，用分光光度法檢測(cè)，在590nm處有吸光度。

4 毛細(xì)管電泳法

熊彩僑等[22]采用毛細(xì)管電泳法，對(duì)廣西7種不同產(chǎn)地的八角茴香中莽草酸的含量進(jìn)行測(cè)定，具體做法是超生提取后以5mmol/l緩沖液，60mmol/lSDS四硼酸鈉，12.5kv的運(yùn)行電壓，電進(jìn)樣時(shí)間3s，213nm的檢測(cè)波長(zhǎng)。結(jié)果莽草酸濃度在5~4mmol/l內(nèi)線性良好。安徽蕪湖、福建湘潭、湖北天門、重慶秀山、云南、廣西桂林的莽草酸含量分別為4.75%，7.36%，3.13%，5.91%，2.12%，6.15%，平均回收率為（n=6）102.1%，RSD為7.5%。羅英等[23]建立了毛細(xì)管區(qū)帶電泳-紫外檢測(cè)八角殼和種子莽草酸新的分析方法，優(yōu)化獲得最佳分離條件：采用磷酸鹽-硼砂溶液為緩沖液，NaH2PO4為10nmol/L，硼砂為9nmol/L、pH為8.63、分離電壓為25kV，回收率分別為98.9%和104.6%。Qing-Feng Zhang 等[24]利用毛細(xì)管電泳法測(cè)定土茯苓中莽草酸的含量，pH為9.46、分離電壓為25kV，溫度為25°C和檢測(cè)波長(zhǎng)214nm。Claudia M等[25]用毛細(xì)管電泳法，在pH為7.0，分離電壓為30kV，完成了反式白藜蘆醇中莽草酸的分離和含量測(cè)定。Iben LP等[26]在pH值為7.3，紫外線探測(cè)在206海里，用膠束動(dòng)電毛細(xì)管電泳法完成了對(duì)天然產(chǎn)物中莽草酸含量的測(cè)定。

5 偏最小二乘法-近紅外光譜法

逯家輝等[27]采用PLS建立測(cè)定27個(gè)八角茴香樣品中莽草酸含量的NIR光譜定量分析模型。莽草酸含量為6.585%~9.655%，平均8.649%。結(jié)果證明PLS-NIR檢測(cè)莽草酸的定量分析效果良好。范銘然[28]等采用P LS-NIR建立測(cè)定八角茴香中莽草酸含量的定量分析模型。此模型穩(wěn)定性好、精度高，在天然藥物有效成分定量分析中有廣闊的應(yīng)用前景。

6 電導(dǎo)抑制離子色譜

朱朝娟[29]建立電導(dǎo)抑制離子色譜法測(cè)定八角中莽草酸含量的方法。色譜條件為Metrohm A supp 4(4mm×250mm)型陰離子分析柱，洗液流速0.8mL/min，抑制電流250mA。對(duì)樣品進(jìn)行5次進(jìn)樣，測(cè)得莽草酸平均含量為5.7%，莽草酸質(zhì)量濃度與峰面積有良好線性關(guān)系(r=0.9993)。相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差1.04%，保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.47%，回收率為97.3%～98.9%。此實(shí)驗(yàn)回收率好，靈敏度高，對(duì)測(cè)量莽草酸方法有推動(dòng)作用。

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