LAMP技術在豬傳染病檢測中的應用

李春燕，湯德元*，張曉杰，曾智勇，羅險峰，甘振磊

（1.貴州大學動物科學學院 貴州 貴陽 550025； 2.貴州省動物疫病預防控制中心，貴州 貴陽 550008）

隨著現代分子生物學的迅速發(fā)展，新的核酸擴增技術不斷出現。70 年代初，核酸內切酶的發(fā)現使人們能夠通過分子克隆的方法分離并克隆基因。傳統(tǒng)的分子克隆技術包括酶切、連接、轉化、培 養(yǎng)以及同位素標記、探針的篩選等過程，大約要用1～2 周時間才能完成。80 年代中期，人們建立了聚合酶鏈式反應技術(Polymerase Chain Reaction，PCR)，將DNA 擴增過程縮短到了2 h～3 h，使得分子克隆技術得到了突破性的改進。然而該技術的特點是溫度梯度的循環(huán)變化，因此需要特殊的實驗設備。目前，核酸擴增技術的一大研究熱點是恒溫反應，即在恒溫條件下實現對靶標序列的大量擴增，從而不需要特殊的實驗設備。而當前恒溫擴增技術主要包括鏈置換擴增法(strand displacement amplification，SDA)、核酸序列擴增法(nucleic acid sequencebased amplification，NASBA)、轉錄介導擴增法(Transcription Mediated Amplification，TMA) 和滾環(huán)擴增法(Rolling Circle Amplification，RCA)等。其中環(huán)介導等溫擴增法(LAMP)是由Notomi 等于2000 年開發(fā)的一種新穎的恒溫核酸擴增方法。其特點是針對靶序列的6 個特異性區(qū)域設計2 對引物，利用一種具有鏈置換活性的DNA 聚合酶(Bst DNA polymerase)在等溫條件下(65 ℃左右)放置30～60 min，即可實現核酸的大量擴增，并且伴有肉眼可見的副產物白色焦磷酸酶沉淀產生。LAMP 技術以其特異性強、靈敏度高、快速準確和操作簡單等優(yōu)點，在核酸的科學研究、疾病的診斷和預防、動物胚胎的性別鑒定和轉基因食品檢測等領域得到了日益廣泛的應用。本文主要綜述了LAMP 技術在豬傳染病檢測中的作用，為該技術的深入研究和應用提供參考。

1 LAMP技術的原理

等溫擴增反應(LAMP)是對靶基因的6 個特異部位設定2 對引物，利用具有鏈置換活性的Bst DNA 聚合酶在恒溫條件下催化新鏈合成，從而使靶基因高效擴增，其反應體系還包括模板DNA、dNTP 和緩沖液。其基本操作過程是將LAMP 反應體系(除Bst DNA聚合酶)在95℃加熱5min 后，冷卻，再加入8U Bst DNA 聚合酶，在63℃保溫60 min，然后在高于80 ℃的溫度下加溫2 min 終止反應。

等溫擴增反應4 條引物中2 條為內引物，2 條為外引物。內引物FIP(forward inner primer) 包含F1c序列和F2(F2c 區(qū)域的互補序列)，即5′-F1c-F2；內引物BIP(backward inner primer)包含B1c(B1 區(qū)域的互補序列) 和B2 序列，即5′ -B1c-B2。外引物為F3 和B3 序列。靶序列上的6個特異區(qū)域：F2c 和B2，F1c 和B1（分別位于F2c 和B2 內側），F3c 和B3（分別位于F2c 和B2 外側），序列長度約為17nt～24nt 的[1]。

在LAMP 循環(huán)擴增階段，這種啞鈴結構的DNA 為循環(huán)反應提供了原料，啞鈴結構的DNA 通過自我引導延伸，生成雙鏈莖環(huán)結構，循環(huán)反應中引物FIP 結合到莖環(huán)DNA 的環(huán)狀結構上，引導合成新的DNA 雙鏈，同時置換出與之相同序列的鏈，形成一個過渡性莖環(huán)結構DNA，在其莖上含有一個靶序列反向拷貝，而另一端通過BIP 形成一個環(huán)狀結構，在隨后自我引導的鏈置換DNA 合成反應中生成一條填補好缺口、長度為靶DNA 2 倍的莖環(huán)DNA 和一個與結構6 互補的DNA 鏈。這樣就在結構6 和結構12 之間建立了循環(huán)反應。結構8 和結構14 可為伸長和再循環(huán)階段中由內引物引導的鏈置換反應提供模板。在伸長和再循環(huán)階段，內引物引導鏈置換延伸反應，莖環(huán)個數逐漸增加，最后的擴增產物是一系列反向重復的靶序列構成的莖環(huán)結構和多環(huán)花椰菜樣結構的DNA 片段混合物。

LAMP 擴增產物檢測一般包括以下3 種方式：（1）SYBR Green I 檢測，在反應液中加入SYBR Green I，可在紫外燈或日光下通過肉眼進行擴增結果判定。如果含有擴增產物，反應混合物變綠；反之，則保持SYBR Green I 的橙色不變；（2）副產物-焦磷酸鎂的濁度檢測，這種檢測方式具有極高的特異性，使用濁度儀甚至肉眼觀察就能夠判斷擴增與否；（3）瓊脂糖電泳檢測，因LAMP 產物均為初始結構的整數倍，擴增產物經瓊脂糖電泳后形成特異的梯狀條帶。

2 LAMP技術方法上的延伸

Nagamine[2]通 過 在F1c-F2c/B1c-B2c 之間創(chuàng)新性地設計一對環(huán)引物Loop F/Loop B，大大縮短了LAMP反應的時間，整個擴增反應在0.5h 即能完成。環(huán)引物通過結合在莖環(huán)結構的環(huán)狀區(qū)域互補序列上，大大加速了整個鏈置換反應過程，從而提高了反應效率。Nagamine[3]建立了一種分離LAMP 反應產物單鏈DNA 的方法使LAMP 技術能夠應用于微陣列分析，并證明通過在內引物上設計TspRI 限制性酶切位點可以使這種方法得到推廣。Maruyama[4]建立了insitu LAMP 檢測方法對攜帶stx2 基因的細菌進行了原位檢測，由于其溫和的穿透條件及較低的溫度要求，相比原位PCR，其對細胞的傷害要小得多，對細胞結構的破壞較小。Fukuta 建立了RT-LAMP 方法并成功將其用于番茄斑萎病毒的檢測，使LAMP 技術的應用拓展到RNA 病毒檢測。Hong 等建立了SARS 的一步法單管RT-LAMP 檢測方法，大大簡化了LAMP 技術用于RNA 病毒檢測的操作步驟。Aoi 建立了胺氧化細菌的Real-time quantitative LAMP 檢測方法，使LAMP 技術能夠應用于核酸的定量測定。

3 LAMP技術在豬傳染病檢測上的應用

LAMP 和RT-LAMP 技 術 以 其 特異性強、靈敏度高、速度快和操作簡單等特點而倍受人們青睞。在豬病方面主要用于細菌疫病、病毒疫病和某些寄生蟲的DNA 或RNA 的檢測，已在豬傳染病的檢測中起到了一定的作用，現分述如下：

3.1 LAMP 技術用于細菌的檢測

3.1.1 用于大腸桿菌的檢測

大 腸 桿 菌（Escherichia coli，E.coli）可以引起仔豬白痢、仔豬黃痢和豬水腫病。傳統(tǒng)細菌分離費時費力并且一些快速檢測方法容易與其他型大腸桿菌混淆產生假陽性。Maruyama等2003 年首次采用LAMP 方法快速檢 測E.Coli Ol57:H7O27( 有 一 個stxl 基因和兩個stx2 基因)的stx2 基因，并用FITC 標記抗E.Coli O157:H7 抗體，在紫外下照射。試驗結果顯示，較原位PCR 而言，溫和的滲透性及低等溫條件使得原位LAMP 引起較少的細胞損傷，并且在DNA 擴增中允許使用熒光抗體標記。Yano 等用LAMP 技術對腸毒素大腸桿菌的LTI 及STI 基因進行研究，實驗結果再次證明了LAMP 的特異性(非LTI 及STI 基因型的Ecoli及其他細菌均不擴增)及高靈敏性和高效性，加入環(huán)引物后擴增時間可以從60min 縮至35min。

3.1.2 用于沙門氏菌的檢測

《規(guī)劃》對河道背水側管理范圍內的護堤地用材林進行空白段新造林和疏林地、成熟林、過熟林地的更新改造，選擇速生、材質好、耐粗放管理和耐病蟲害的鄉(xiāng)土樹種。新造林采用生長較快的楊樹、泡桐等樹種；更新改造采用櫸樹、楸樹造林；采取株行距4 m×5 m的塊狀混交方式。在河道背水側護堤地栽植用材林，不僅可以有效增加林木原料儲備，為防汛提供搶險木材，而且可以形成以堤防為軸線的防風林帶，與臨水側的防浪林互配互襯，成為林水結合的綠色長廊。

沙門氏菌病是由沙門氏菌（Salmonella）引起的一種人、畜共患的傳染病。豬霍亂沙門氏菌是引起仔豬副傷寒的主要病原菌，給養(yǎng)豬業(yè)造成重大危害。Hara-Kudoa 等對沙門氏菌的39 個血清型220 個菌株進行了LAMP檢測，靈敏度達到2.2 CFU/管，明顯高于常規(guī)PCR。朱勝梅[5]等以沙門氏菌為研究對象，根據其特異性的invA基因，設計了一套特異性引物對該基因進行了LAMP，同時優(yōu)化了其反應條件，在此條件下，LAMP 檢測沙門菌DNA的敏感度達10 fg/反應，且與其他常見的細菌無交叉反應。

3.1.3 用于副豬嗜血桿菌的檢測

副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis，H P)為革蘭氏陰性短小桿菌，形態(tài)多變，該菌生長需要煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD 或V 因子)，一般條件下難以分離和培養(yǎng)。朱杰儀[6]等根據GenBank 上發(fā)表的不同血清型Hps 的16S rRNA 序列，找出其高度保守區(qū)域，再針對該區(qū)域設計了4 條特異性引物，建立了Hps 環(huán)介導等溫擴增法。試驗結果表明，LAMP 方法在恒溫(63℃)條件下特異性強，比PCR 方法敏感100 倍。鑒于目前副豬嗜血桿菌分離培養(yǎng)和鑒定的復雜性，LAMP 方法操作簡單、成本低，整個擴增反應在1h 內即可完成，為檢測Hps 提供了一個快速簡便的分子生物學方法。

3.1.4 用于豬胸膜肺炎放線桿菌的檢測

豬傳染性胸膜肺炎又稱為豬胸膜肺炎放線桿菌病，是由胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus P1europneumoniae，APP)所引起的一種危害豬呼吸道的疾病，以胸膜炎和肺炎癥狀及病變?yōu)樘卣鳌＠罴押痰萚7]以I 型豬胸膜肺炎放線桿菌ApxIV 基因片段為靶序列設計了一組引物，建立了敏感、特異的豬胸膜肺炎放線桿菌環(huán)介導等溫擴增檢測方法。在63 ℃等溫條件下反應45 min，最低可檢測到102個拷貝的目的基因，敏感性是PCR 方法的10 倍。通過對8 頭豬胸膜肺炎放線桿菌實驗感染豬和127 份臨床發(fā)病豬的鼻拭子進行檢測，發(fā)現該方法對鼻拭子中豬胸膜肺炎放線桿菌的檢出率為100%，明顯優(yōu)于PCR 方法。

3.2 LAMP 技術用于豬病毒的檢測

3.2.1 用于日本腦炎病毒的檢測

流行性乙型腦炎簡稱乙腦，是由黃病毒科(Flaviridae)黃病毒屬乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)引起的一種嚴重威脅人畜健康的急性中樞神經系統(tǒng)傳染病，是重要的人畜共患病及蟲媒病毒病。Toriniwa 等[8]利用LAMP 原理建立了一個快速且能定 量 的Real-time RT-LAMP 方 法，通過擴增JEV 的包膜(E)蛋白基因來定量檢測JEV，將檢測時間縮短至1h，檢測下限為1PFU，其敏感性與常規(guī)RT-PCR 相似；同時作者利用所建立的RT-LAMP 法對與JEV 同家族的森林腦炎病毒和相關病毒(登革熱病毒和西尼羅河病毒)進行了擴增，均未檢測出，結果顯示了所建立的RT-LAMP法對JEV 檢測的高度特異性；另外，作者把通過RT-LAMP 檢測出的病毒數量與用常規(guī)病毒定量方法檢測出的數量比較顯示兩個結果高度相符，作者認為RT-LAMP 是一種快速的定量檢測JEV 的方法。由于其不需特殊的儀器設備，有利于其在經濟不發(fā)達地區(qū)的運用。

3.2.2 用于口蹄疫病毒的檢測

口蹄疫(Foot and Mouth Disease，FMD)是偶蹄動物的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病?？谔阋卟《緦儆谛NA 病毒科，口蹄疫病毒屬，該病毒有7 個血清型，各型之間無交叉保護反應。吳紹強等[9]以滅活的亞洲Ⅰ型口蹄疫細胞培養(yǎng)病毒為材料，通過在病毒基因組的3D 區(qū)域設計3 對引物，建立口蹄疫病毒的RT-LAMP 檢測方法，對反應體系中的成分以及反應條件（反應溫度）分別進行優(yōu)化，并進行敏感性和特異性確定。建立了亞洲Ⅰ型口蹄疫病毒的RT-LAMP 檢測方法，為口蹄疫的現場快速檢測提供了一種更加簡便快速的方法，可以滿足現場檢疫的需要。

3.2.3 用于豬繁殖與呼吸綜合征病毒的檢測

豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus，PRRSV) 屬 于 單 股正鏈RNA 病毒，該病毒可引起的一種豬急性高致死性傳染病。趙彥宗等[10]根據GenBank 中登錄的PRRSV M 基因保守序列6 個特異性部位設計了2 對引物，建立了PRRSV 的環(huán)介導逆轉錄等溫檢測方法。結果表明，該方法靈敏度比RT-PCR 高100 倍；全部反應可在1h 內完成并可得到其特有的階梯狀條帶，而且豬圓環(huán)病毒、豬瘟病毒、豬偽狂犬病毒的擴增結果均為陰性；在反應體系中添加SYBR GREEN Ⅰ染料后，可通過肉眼觀察有無熒光而直接判定結果。該方法靈敏度高、特異性好，可作為豬繁殖與呼吸綜合征病毒的快速診斷方法。

3.2.4 用于豬瘟病毒的檢測

豬瘟是由豬瘟病毒(Classical Swine Fever Virus，CSFV)引起豬的高度傳染性致死性病毒性疫病。劉中勇等[11]設計了4 條針對豬瘟病毒6 個位點的特異性引物，建立了一種靈敏、特異、快速的豬瘟病毒體外等溫擴增(RT-LAMP)檢測方法，所建立的方法能夠特異地檢測出豬瘟病毒的存在，檢測PRV、PRRSV、PCV2 等病毒均為陰性；靈敏度高，所建立的CSFVRT-LAMP 方 法 靈 敏 度 為10-5， 總RNA 的檢測閾值約為1pg；反應快速，整個擴增反應可在1h 內完成；操作簡單，不需要PCR 儀等復雜的儀器，結果可經肉眼觀察及電泳檢測。本試驗為豬瘟的現場快速檢測提供更加簡便、快速的方法，可以滿足基層檢疫的需要。

3.2.5 用于非洲豬瘟病毒的檢測

非洲豬瘟(ASF)是由非洲豬瘟病毒(ASFV)引起的豬的急性、接觸性傳染病，主要特征是高熱、皮膚發(fā)紺以及淋巴結和內臟器官的嚴重出血，死亡率可高達100%。江彥增等[12]利用環(huán)介導等溫擴增技術(LAMP)建立了一種快速高效檢測非洲豬瘟病毒的方法。整個反應在水浴鍋中恒溫進行，不需要其他昂貴儀器，30 min 即可得到陽性結果，靈敏度是OIE 標準PCR 方法的100 倍，并且與其他常見豬DNA 病毒無交叉反應。該方法非常適合在野外現場或缺乏試驗條件的邊遠地區(qū)檢測非洲豬瘟病毒。

3.2.6 用于豬細小病毒的檢測

豬細小病毒(Porcine Parvovirus，PPV)屬細小病毒科細小病毒屬，為無囊膜的單股線狀DNA 病毒，是引起母豬繁殖障礙的主要病原體之一。劉業(yè)兵等[13]根據GenBank 公布的PPV序列，在其保守序列區(qū)域設計了多套LAMP 引物，利用LAMP Real Time Turbidimeter LA-320 儀監(jiān)測反應進程并篩選最佳引物、反應條件，建立了對PPV 病毒DNA 進行特異擴增的LAMP 檢測方法，并可通過加入SYBR Green I 肉眼判斷結果。該方法在63℃恒溫下作用45min，PPV 病毒DNA 獲得了高效率的特異性擴增；其檢出限量為0.23 TCID50，敏感性高；在反應結束后加入SYBR Green I 肉眼判斷結果，與Real Time Turbidimeter LA-320 儀監(jiān)測結果一致。通過對20份臨床樣品的LAMP 檢測與免疫熒光鑒定、PCR 方法比對，符合率均為20/20。從而建立了一種快速、敏感、特異的檢測豬細小病毒（PPV）環(huán)介導等溫擴增（LAMP）方法，為診斷豬細小病毒提供準確可靠工具。

3.2.7 用于豬圓環(huán)病毒2 型的檢測

豬圓環(huán)病毒(Porcine circovirus，PCV)為圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬成員，是已知最小的動物病毒之一。根據抗原性及基因組組成，PCV分成兩個血清型，即PCV1 和PCV2，而PCV1 無 致 病性。楊得勝[14]以豬圓環(huán)病毒2 型為材料，設計了3 對引物，構建了豬圓環(huán)病毒2型環(huán)介導等溫擴增（LAMP）檢測方法，并進行敏感性和特異性確定。建立的豬圓環(huán)病毒2 型的LAMP 檢測方法，可以采用瓊脂糖凝膠電泳、顏色變化、生成的沉淀等現象判定反應結果，為豬圓環(huán)病毒2 型的現場快速檢測提供了一種更加簡便快速的方法，可以滿足現場檢疫的需要。

3.3 LAMP 技術用于豬寄生蟲的檢測

LAMP 技術用于豬寄生蟲方面，目前主要用于豬附紅細胞體的檢測。豬附紅細胞體病是由豬附紅細胞體寄生于豬紅細胞表面或游離在血漿中引起的一種以貧血、黃疸、發(fā)熱等為主要臨床特征的人畜共患?。ㄘi附紅細胞體屬寄生蟲，也有人認為是立克次氏體目，目前尚未形成共識）。李月梅等[15]利用LAMP技術成功檢測到豬附紅細胞體基因區(qū)，并用10 倍系列稀釋的DNA 樣品對該檢測方法的靈敏度進行了測試，此方法的靈敏度可達到5×105倍稀釋的DNA 分子水平，并且特異性強，對新孢子蟲、弓形蟲、瑟氏泰勒蟲病原體檢測均為陰性。

當前，LAMP 技術已經得到了廣泛的應用，并且已開發(fā)出用于LAMP引物設計的相關軟件， 如Primer Explorer version 3 軟件，使引物設計更加簡便。但LAMP 技術本身仍存在一些未闡明的問題，例如Nagamine[16]曾報道DNA 模板在不預變性的條件下也能發(fā)生LAMP 擴增，但其機制尚不清楚，如果這種現象的原因得以闡明，將進一步簡化LAMP 技術的操作程序。綜上所述，LAMP 技術是一種便捷、特異而又靈敏的快速基因檢測技術，與PCR 和Real-time PCR 相比不需要特殊的儀器設備，如果對其進一步優(yōu)化、完善，該技術必將在食品安全、疾病診斷及基因芯片等領域發(fā)揮重要的作用。

[1] Hirayama H, Kageyama S, Moriyasu S，et al.Theriogenology, 2004,62(5): 887-8961

[2] Nagamine K, Hase T, Notomi T.Accelerated reaction by loopmediated isothermal amplification using loop primers[J].Molecular and cellular probes，2002，16(3):223-229.

[3] Nagamine K,Kuzuhara Y,Notomi T.Isolation of single stranded DNA from loop-mediated isothermal amplification products [J].Biochemical and biophysical research communications，2002，290(4):1195-1198.

[4] MaruyamaF, Kenzaka T,Yamaguchi N, et al.Detection of bacteria carrying the stx2gene by insitu loop-mediated isothermal amplification[J].Appliedand environmental microbiology, 2003,69(8): 5023-5028.

[5] 朱勝梅，吳佳佳，徐馳，等. 環(huán)介導等溫擴增技術快速檢測沙門菌[J].現代食品科技，2008，24(7):725-730.

[6] 朱杰儀，譚實勇，曾小娜，等.副豬嗜血桿菌環(huán)介導等溫擴增檢測方法的建立[J].中國畜牧獸醫(yī)，2010，37(2):204-207.

[7] 李佳禾，李一婧，付萍，等.豬胸膜肺炎放線桿菌環(huán)介導等溫擴增檢測方法的建立與應用[J].農業(yè)生物技術學報，2009，17(6):948-953.

[8] Toriniwa H, Komiy A T. Rapid detection and quantification of Japanese encephalitis virus by realtime reverse transcription loopmediated isothermal amplification[J]. Microbiol Immunol, 2006, 50(5):379-387.

[9] 吳紹強，孫曉智，林祥梅，等. 亞洲Ⅰ型口蹄疫病毒環(huán)介導等溫擴增（LAMP）檢測方法的建立[J]. 檢驗檢疫科學2008，18 (1):9-12.

[10] 趙彥宗，張顯浩，余小利，等. 豬繁殖與呼吸綜合征病毒 M 基因 RT-LAMP檢測方法的建立[J]. 中國畜牧獸醫(yī)，2009，36(12):53-56.

[11] 劉中勇，曾小娜，朱道中，等. 豬瘟病毒 RT-LAMP 快速檢測方法的建立[J].中國畜牧獸醫(yī)，2010，37(6)71-74.

[12] 江彥增，朱鴻飛.非洲豬瘟病毒環(huán)介導等溫擴增快速檢測方法的建立[J].中國畜牧獸醫(yī)，2009，36(2):72-74.

[13] 劉業(yè)兵，張 磊，寧宜寶，等. 豬細小病毒 LAMP 檢測方法的建立[J].中國農業(yè)科學，2010，43(14):3012-3018

[14] 楊得勝. 豬圓環(huán)病毒2 型環(huán)介導等溫擴增檢測方法的建立與應用[J].福建畜牧獸醫(yī)，2009，31(6) 6-9.

[15] 李月梅，薛書江，邢瑩，等.豬附紅細胞體環(huán)介導等溫擴增快速檢測方法的建立[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2010(3):104-105.

[16] Nagamine K, Watanabe K, Oht suka K, et al. Loop-mediated isothermal amplification reaction using a nondenatured template[J]. Clinical chemistry, 2001, 47(9):1742-1743.