流式細(xì)胞分選術(shù)的應(yīng)用進(jìn)展

黃瑩瑩

（浙江大學(xué) 醫(yī)學(xué)部公共平臺(tái)，浙江 杭州 310058）

流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)是一項(xiàng)新型的、發(fā)展迅速的生物醫(yī)學(xué)分析技術(shù)，它不僅可以對(duì)細(xì)胞、微生物等進(jìn)行檢測(cè)分析，而且還可以根據(jù)顆粒特性進(jìn)行分選，具有檢測(cè)速度快、測(cè)量指標(biāo)多、采集數(shù)據(jù)量大等特點(diǎn)，因而被廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、腫瘤學(xué)、血液學(xué)、藥物開(kāi)發(fā)、環(huán)境檢測(cè)、食品衛(wèi)生防疫等科學(xué)研究和工作中[1]。

1 流式細(xì)胞術(shù)的概念

流式細(xì)胞術(shù)是20世紀(jì)60年代末開(kāi)始發(fā)展起來(lái)的技術(shù)，它是集激光技術(shù)、光電測(cè)量技術(shù)、電子生物技術(shù)、電子計(jì)算機(jī)技術(shù)、流體力學(xué)以及熒光化學(xué)技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)為一體的新型高科技細(xì)胞分析技術(shù)。流式細(xì)胞儀是應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)的有效工具，它使細(xì)胞或微粒在鞘液包裹下流動(dòng)，逐個(gè)通過(guò)激光聚焦區(qū)，并用高靈敏度的光學(xué)系統(tǒng)收集各散射光及熒光信號(hào)，再經(jīng)過(guò)計(jì)算機(jī)系統(tǒng)對(duì)采集的信號(hào)進(jìn)行存儲(chǔ)、顯示，從而得以對(duì)粒子進(jìn)行多參數(shù)分析，包括諸如粒子顆粒度和大小、細(xì)胞周期、細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子、細(xì)菌表面抗原、多分子復(fù)合體排列、多價(jià)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)等[2]。分選型流式細(xì)胞儀一般還有篩分的作用，可以根據(jù)所檢測(cè)顆粒的某種性質(zhì)進(jìn)行分選和回收，用于后續(xù)功能實(shí)驗(yàn)。并且，如果整個(gè)分選的過(guò)程是在無(wú)菌條件下進(jìn)行的，分選下來(lái)的細(xì)胞還可以用來(lái)繼續(xù)培養(yǎng)。在我國(guó)，20世紀(jì)90年代初已開(kāi)始研發(fā)應(yīng)用流式無(wú)菌分選的技術(shù)[3]。

2 流式細(xì)胞分選的原理

分選型流式細(xì)胞儀一般由液流系統(tǒng)、光路系統(tǒng)、檢測(cè)分析系統(tǒng)和分選系統(tǒng)4部分組成。流式的分選功能是通過(guò)鞘液流形成含有細(xì)胞的帶電液滴而實(shí)現(xiàn)的。在流動(dòng)室的噴嘴上裝有一個(gè)高速振蕩器，該裝置在充電后以每秒幾萬(wàn)次的振動(dòng)頻率，使鞘液流成為上萬(wàn)個(gè)液滴；目前，先進(jìn)的分選型流式細(xì)胞儀震蕩速度可以達(dá)到10萬(wàn)/s。此時(shí)，細(xì)胞的熒光和散射光信號(hào)已被測(cè)量（即判斷液滴是否該被分選），這時(shí)給鞘液流一個(gè)充電脈沖信號(hào)，待分選的液滴就全部帶上了電荷。流式細(xì)胞分選儀的檢測(cè)分析系統(tǒng)通過(guò)分選設(shè)門(mén)特性迅速判定其是否為靶細(xì)胞。當(dāng)充以不同電荷的含細(xì)胞的鞘液滴流經(jīng)帶有正負(fù)幾千伏恒定靜電電場(chǎng)的偏轉(zhuǎn)板時(shí)，就根據(jù)自身所帶的電荷性質(zhì)產(chǎn)生偏轉(zhuǎn)而落入各自的收集管中，不帶電荷的液滴就進(jìn)入廢液槽中，從而實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞的流式分選[4]。

現(xiàn)代高端型流式細(xì)胞分選儀每秒可以實(shí)時(shí)檢測(cè)定量分析、分選數(shù)萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，儀器可選配3-9根激光管，最多可檢測(cè)l8個(gè)熒光參數(shù)，從而滿足日益多元化的、深入的前沿科學(xué)研究的需要[1]。

3 流式細(xì)胞分選術(shù)的應(yīng)用

3.1 利用流式細(xì)胞分選術(shù)分選腫瘤干細(xì)胞

腫瘤干細(xì)胞是腫瘤中具有自我更新、無(wú)限增殖及多向分化潛能的細(xì)胞，這部分細(xì)胞雖然只占少部分，但在腫瘤的發(fā)生、演進(jìn)、復(fù)發(fā)、耐藥及逃逸免疫系統(tǒng)的識(shí)別和清除過(guò)程中可能發(fā)揮了至關(guān)重要的作用[5]。因此，建立有效的腫瘤干細(xì)胞分離方法，將有助于人們深入了解腫瘤的發(fā)病機(jī)理，從而建立新的有效的治療方法。例如，王玲燕等（2012）[5]采用流式細(xì)胞分選術(shù)從人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7中分選CD44+CD24-/low乳腺癌干細(xì)胞，進(jìn)行了干細(xì)胞比例分析，并用免疫熒光法檢測(cè)、比較分選獲得的細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞的干性和分化標(biāo)記物的表達(dá)狀態(tài)。結(jié)果表明分選獲得的CD44+CD24-/low乳腺癌于細(xì)胞陽(yáng)性比例達(dá)90%以上，即CD44+CD24-/low表面標(biāo)記物分選的方法可以富集高純度的乳腺癌干細(xì)胞。Yang等[6]通過(guò)流式分選從肝癌組織中分離出了CD45-CD90+細(xì)胞，研究表明CD45-CD90+可以用來(lái)作為人類肝癌的一個(gè)標(biāo)志物，亦能成為診斷和治療該惡性腫瘤的重要靶點(diǎn)。近期，Hassan等[7]又通過(guò)流式分選得到了具有類似肺癌干細(xì)胞的細(xì)胞群，通過(guò)對(duì)其功能進(jìn)行研究，可為肺癌的治療提供有力的參考依據(jù)。

3.2 利用流式細(xì)胞分選術(shù)分選外周血細(xì)胞

傳統(tǒng)的從外周血分離單核細(xì)胞的方法一般需要反復(fù)離心清洗，會(huì)造成大量細(xì)胞損失，如需獲取純度較高的單核細(xì)胞，則需要進(jìn)一步利用抗體、磁珠等技術(shù)加以純化，實(shí)驗(yàn)成本較高，且獲得的單核細(xì)胞容易被激活而給實(shí)驗(yàn)結(jié)果帶來(lái)影響?；诹魇郊?xì)胞儀的分選功能，根據(jù)細(xì)胞的大小以及顆粒度等特征，對(duì)白細(xì)胞直接進(jìn)行分選獲取人外周血中的單核細(xì)胞的方法，既避免了多次重復(fù)離心，又能分選得到純度在80%-90%之間的單核細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，為深入研究單核細(xì)胞提供了良好的技術(shù)平臺(tái)[8]。此外，李璐等應(yīng)用流式細(xì)胞分選儀分離中性粒細(xì)胞，陽(yáng)性細(xì)胞收集率和純度均非常高，試驗(yàn)證實(shí)可達(dá)99%，且分離時(shí)間較短；該方法特別適合含量稀少、比較珍貴細(xì)胞的分離[9]。本實(shí)驗(yàn)室的流式細(xì)胞分選儀曾根據(jù)課題組[10]的研究需要，從脾臟或胸腺中分選目的T細(xì)胞細(xì)胞亞群，分選純度達(dá)98%以上，分選活性好，為后續(xù)工作的開(kāi)展提供了高純度高質(zhì)量的細(xì)胞。

3.3 利用流式細(xì)胞分選術(shù)分選染色體

由于基因組太大或重復(fù)DNA和多倍體的存在造成的序列冗余，許多植物物種的基因組分析經(jīng)常比較困難。Vrána等[11]通過(guò)流式分選的方法得到了高質(zhì)量的單個(gè)染色體，該方法可同時(shí)純化大量染色體，為后續(xù)試驗(yàn)，如植物基因組測(cè)序等提供了方便。

3.4 利用流式細(xì)胞分選術(shù)分選造血干細(xì)胞

造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cell，HSC)為血液系統(tǒng)最原始的細(xì)胞，具有自我更新、自我維持并向多系分化與增殖的能力，在整個(gè)造血細(xì)胞群體中僅占很小比例，一直是成體干細(xì)胞研究中的熱點(diǎn)。徐勇等[12]聯(lián)合應(yīng)用免疫磁珠分離和流式細(xì)胞分選術(shù)，可以較高的回收率快速純化高純度的早期造血干細(xì)胞亞群。李喬等[13]通過(guò)配制HSCs體外培養(yǎng)液并結(jié)合流式細(xì)胞分選技術(shù)，建立了一種在體外不需要基質(zhì)細(xì)胞支持的，穩(wěn)定的，高通量培養(yǎng)單個(gè)HSC形成一個(gè)血細(xì)胞集落的實(shí)驗(yàn)方法。

3.5 利用流式細(xì)胞分選術(shù)分選神經(jīng)細(xì)胞

在體模型中星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元這些組織結(jié)合非常緊密，過(guò)去由于研究技術(shù)的局限，分開(kāi)它們的方法很困難，因此研究分離神經(jīng)細(xì)胞的方法即成為近年來(lái)國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究的熱點(diǎn)。如王萍等[14]通過(guò)反復(fù)實(shí)踐摸索建立了一種較為完善的流式細(xì)胞儀分選在體模型中神經(jīng)細(xì)胞的技術(shù)方法，該分選方法可以同時(shí)獲得純度高、數(shù)量多的不同種類的神經(jīng)細(xì)胞。

3.6 利用流式細(xì)胞分選術(shù)建立穩(wěn)定細(xì)胞轉(zhuǎn)染株

對(duì)于用于體內(nèi)動(dòng)物模型的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的獲得，陳亞靜等[15]研究發(fā)現(xiàn)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、有限稀釋法獲得單克隆細(xì)胞株效率較低；而通過(guò)體內(nèi)傳代，流式分選并單克隆化，是獲得致瘤性好，體內(nèi)體外較為穩(wěn)定的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的一個(gè)可行方案。近期，陳媛等[16]亦利用逆轉(zhuǎn)錄病毒將非融合形式的綠色熒光蛋白質(zhì)GFP和目的基因穩(wěn)定整合至靶細(xì)胞的基因組中，經(jīng)過(guò)流式分選獲得GFP陽(yáng)性細(xì)胞，即為穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白的細(xì)胞株；該方法高效快捷，極大地提高了穩(wěn)定細(xì)胞株的構(gòu)建效率，同時(shí)該穩(wěn)定細(xì)胞株的建立也為未知目的蛋白的功能研究提供了有用的工具。

4 結(jié)語(yǔ)

近年來(lái)，隨著各項(xiàng)科學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，多學(xué)科之間的相互結(jié)合成為大的趨勢(shì)。流式細(xì)胞分選術(shù)具有其自身特點(diǎn)及應(yīng)用優(yōu)勢(shì)，隨著其功能的不斷完善，必將成為高等院校及科研機(jī)構(gòu)在醫(yī)學(xué)、生命科學(xué)、藥學(xué)、食品及化學(xué)等眾多學(xué)科實(shí)驗(yàn)教學(xué)、科研的重要技術(shù)手段；該技術(shù)在監(jiān)測(cè)、檢測(cè)、臨床等領(lǐng)域亦會(huì)有更廣泛、深入的應(yīng)用前景。當(dāng)然，精密、靈敏的儀器還需要精細(xì)的維護(hù)和日常校準(zhǔn)，一個(gè)好的儀器共享平臺(tái)必將會(huì)為先進(jìn)技術(shù)的應(yīng)用提供有力的支撐與推動(dòng)。

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