血紅蛋白在膜修飾電極的電還原機(jī)制分析

謝 英 冉 升

(1.保定學(xué)院生化系，河北 保定 071000;2.保定市第二中學(xué)，河北 保定 071000)

血紅蛋白(Hb)是人體中一類重要的生物大分子，其具有運(yùn)氧功能。定量測定血清中Hb是疾病檢測、生化分析的重要指標(biāo)，電化學(xué)方法在生物化學(xué)分析方面應(yīng)用廣泛，然而Hb在未修飾電極上過電位很大，很難發(fā)生還原反應(yīng)，檢測不到電流信號。文獻(xiàn)表明可以加入修飾媒介體[1]或加入促進(jìn)劑[2]。本文研究Hb在月桂酸、膽固醇和大豆卵磷脂修飾的玻碳電極上的電化學(xué)行為，運(yùn)用循環(huán)伏安方法、數(shù)值分析和計算機(jī)模擬為基本的研究手段，以期得到合理的理論模型，繼而有效地控制Hb的電還原過程。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

儀器:電化學(xué)工作站(美國普林斯頓公司)，工作(月桂酸、大豆卵磷脂和膽固醇修飾的玻碳電極)、輔助(大面積的鉑片電極)、參比電極(Ag/AgC1電極)組成的三電極體系。

試劑:牛血紅蛋白，月桂酸，大豆卵磷脂，膽固醇、氯化鉀，氯仿等。0.02mol/L磷酸二氫鉀和磷酸氫二鈉(pH=5～8)為緩沖溶液.所用試劑均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計

以血紅蛋白在磷酸二氫鉀和磷酸氫二鈉緩沖溶液中，玻碳電極依次經(jīng)丙酮、稀硫酸(1.00mol/L)、去離子水超聲洗滌。用Al2O3粉末拋光，再用去離子水清洗電極，最后用濾紙將電極表面吸干。將已拋光的玻碳電極倒立且固定在干燥的燒杯內(nèi)，用微量注射器取成膜液(月桂酸、大豆卵磷脂、膽固醇)5μL均勻滴加在電極表面，蓋好玻璃罩待溶劑揮發(fā)后測定血紅蛋白濃度，溶液PH，電勢掃描速率等對峰電流的影響。

2 結(jié)果與討論

2.1 循環(huán)伏安圖譜的直觀信息

2.1.1 不同電勢掃描速率下的循環(huán)伏安響應(yīng)譜

由圖可知，無陽極氧化峰出現(xiàn)，陰極呈現(xiàn)出單一的還原峰，且電勢掃描速率越高該還原峰電勢越小，故可認(rèn)為血紅蛋白在該膜修飾的電極電催化還原反應(yīng)為不可逆。

2.1.2 連續(xù)多次循環(huán)伏安掃描測試

連續(xù)多次伏安掃描測試中，血紅蛋白還原峰電流先增加后減小，因而可認(rèn)為血紅蛋白在該膜修飾電極的電催化還原反應(yīng)有弱吸附現(xiàn)象。

(圖1 不同掃描速率下的循環(huán)伏安曲線，血紅蛋白濃度:1.01 ×10-6 mol/L，pH=5.00。響應(yīng)曲線1—6所對應(yīng)的電掃描速率分別為，10、20、40、60、80 和100mV/s)

2.2 信息數(shù)據(jù)的解析與擬合

2.2.1 血紅蛋白的[ip，V]PH，c數(shù)據(jù)集的線性回歸處理

分別對

ipa=ka×v (2)線性回歸擬合，

(表1 不同溶液pH條件下ip對，ip對V的回歸處理血紅蛋白濃度:1.00 ×10-6Mol/L;電勢掃描速率 ν 在10 ～100mV/s.)

(表1 不同溶液pH條件下ip對，ip對V的回歸處理血紅蛋白濃度:1.00 ×10-6Mol/L;電勢掃描速率 ν 在10 ～100mV/s.)

溶液PH ip=k0+kd×v 1 2 ip=k0+ka ×v k0×106 kd×105 R F×103 K0×106 kd×104 R F×103 8.0 -2.17 3.59 0.985 25.7 1.03 0.867 0.998 1.63 7.5 -2.03 4.51 0.996 3.91 2.11 1.07 0.990 14.4 7.0 -5.29 6.37 0.995 31.9 0.517 1.52 0.994 19.7 6.5 -4.54 5.73 0.993 34.8 0.662 1.37 0.995 8.37 6.0 -6.38 7.46 0.986 75.7 0.294 1.80 0.999 2.19 5.5 -3.55 5.27 0.996 12.2 1.26 1.26 0.996 9.83 5.0 -3.12 4.82 0.998 7.24 1.29 1.15 0.995 13.6

模型擬合，見表1(F為誤差平方和)，線性相關(guān)系數(shù)R≥0.917，但其回歸直線截距k0不為零(與峰電流相比太大)，ip～的數(shù)值都隨電勢掃描速率增大而變大，ip～V的數(shù)值都隨電勢掃描速率增大而減小，不能視為常數(shù)【3】，故不能確定是吸附還是擴(kuò)散控制。

2.2.2 血紅蛋白的[ip，V]PHρ二元線性回歸處理

對涉及電活性質(zhì)粒吸附反應(yīng)體系來說，

(表2 不同溶液PH條件下ip對kd+kav二元線性回歸處理血紅蛋白濃度:1.00×10-6 Mol/L，電勢掃描速率ν在10～100mV/s。)

(表2 不同溶液PH條件下ip對kd+kav二元線性回歸處理血紅蛋白濃度:1.00×10-6 Mol/L，電勢掃描速率ν在10～100mV/s。)

溶液PH kd×106 ka×105 F×102 8.0 10.4 6.32 6.82 7.5 23.5 5.05 4.52 7.0 7.08 13.3 20.1 6.5 7.92 11.7 6.00 6.0 2.54 17.5 3.74 5.5 14.3 9.09 3.86 5.0 14.8 7.85 5.36

采按照ip=ipd+ipa=kd×+ka×v模型進(jìn)行回歸處理結(jié)果F(誤差平方和)值明顯增大。

綜上，對ipd=kd×，ipa=ka× v，ip=ipd+ipa=kd×+ka×v所得出數(shù)據(jù)并不理想，即該擴(kuò)散和吸附行為與電化學(xué)理論中常規(guī)模型并不相同。

2.2.3 血紅蛋白的[ip，C]PH，v數(shù)據(jù)集的回歸處理

(圖2 血紅蛋白的濃度C與還原峰電流ip的關(guān)系(ν=20mv/s，pH=6.0)

圖2中 ip～C 曲線類似 Michaelis-Menton【4】方程，可表示為，考慮到吸附態(tài)活性物質(zhì)對電流有顯著影響，對(4)式進(jìn)行修正得

表3 以(4)(5)式為模型的非線性回歸處理ν=20mv/s，pH=6.0

表3可見，F(xiàn)值更大些，且K0參數(shù)大于[ip，C]PH，v數(shù)據(jù)集中最小濃度對應(yīng)的ip值(2.17×10-7A)。故對(4)和(5)式施以分形修正，給出如下模型

表4 以(6)(7)式為模型的非線性回歸處理ν=20mv/s，pH=6.0

由于 α =2-D=1.34，因而求出分維 D=0.66。

3 結(jié)論

經(jīng)月桂酸、大豆卵磷脂和膽固醇修飾的玻碳電極的微孔粗糙程度不一，且血紅蛋白微粒表面凹凸不平，而電催化反應(yīng)一般是在一系列孤立的點(diǎn)上進(jìn)行，即該電極/溶液界面結(jié)構(gòu)類似于Cantor集合，Hausdorff維數(shù) D=0.66，處于0和1之間Hausdorff維數(shù)(D=0.66)偏離1的程度較大，故可推斷血紅蛋白在經(jīng)月桂酸、大豆卵磷脂和膽固醇修飾的玻碳電極上的電催化還原機(jī)制比較復(fù)雜[5]，可進(jìn)一步研究討論。

[1]袁倬斌，張玉忠，趙紅。分析化學(xué)，2001，29：1332-1335

[2]何亞楠，李根喜，史海蓉等。分析化學(xué)，1997，25(1)：49-51

[3](美)A.J.巴德，L.R.?？思{著，谷林锳等譯。《電化學(xué)方法原理及應(yīng)用》，化學(xué)工業(yè)出版社，1984，616-620

[4]李后強(qiáng)，趙華明。自然雜志，1999，13(6)327-330

[5]丁小勤，胡勁波，李啟隆。蛋白質(zhì)的電分析化學(xué)研究[J]，分析試驗(yàn)室，2006 年01 期