一株瀝青質(zhì)降解菌的篩選及其對(duì)稠油作用評(píng)價(jià)＊

宋永亭，宋 欣，高光軍，陳慶國，李 陽，包木太?

（1.中國海洋大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，山東 青島 266100； 2.海洋化學(xué)理論與工程技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（中國海洋大學(xué)），山東 青島 266100； 3.中國石化股份勝利油田分公司采油工藝研究院，山東 東營 257000； 4.中國石油化工股份有限公司，北京 100728）

目前在中國探明石油儲(chǔ)量中，開發(fā)難度較大的稠油接近40億噸，其資源量約占總石油資源的25%～30%，稠油開發(fā)日益顯示出重要的戰(zhàn)略地位.高黏度是稠油區(qū)別于常規(guī)原油的最基本特性，同時(shí)也是決定稠油開采難度和經(jīng)濟(jì)成本的關(guān)鍵因素.稠油往往富含瀝青質(zhì)，瀝青質(zhì)是稠油組分中相對(duì)分子質(zhì)量最大、極性最強(qiáng)的組分，也是造成稠油黏度大、開采難的一個(gè)主要因素[1－3].

利用微生物作用于稠油，改善稠油物性是石油開發(fā)領(lǐng)域的一項(xiàng)新興技術(shù).目前的研究主要集中在微生物產(chǎn)生生物表面活性物質(zhì)、酸、氣等代謝產(chǎn)物降低稠油黏度；在微生物對(duì)稠油中大分子組分的降解作用方面，國內(nèi)外研究人員也做過一些探索研究.但是，關(guān)于能以瀝青質(zhì)為唯一碳源生長，特異性降解瀝青質(zhì)的菌種的相關(guān)研究報(bào)道較少[4－7].本文以瀝青質(zhì)為唯一碳源，從稠油油田采出水中選擇性富集篩選瀝青質(zhì)降解菌，獲得了一株能夠以稠油中瀝青質(zhì)組分為唯一碳源生長的菌株S，利用該菌株對(duì)富含瀝青質(zhì)的稠油進(jìn)行了微生物降解評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)，分析了菌株對(duì)稠油物理化學(xué)性質(zhì)的影響.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

正庚烷，甲苯，硝酸銨，磷酸氫二鉀，磷酸二氫鉀，七水硫酸鎂，氯化鈣，氯化鈉，葡萄糖，蛋白胨，酵母浸粉，瓊脂粉，稠油（黏度3 581mPa·s），Taqmix擴(kuò)增體系.瀝青質(zhì)抽提器，密度儀，黏度計(jì)，原油族組分測試儀，紅外光譜儀，核磁共振儀，天平，真空干燥箱，振蕩培養(yǎng)箱，PCR儀.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 瀝青質(zhì)降解菌的篩選

富集培養(yǎng)基：NH4NO3，1.0g／L；K2HPO4，1.5 g／L；KH2PO4，0.5g／L；MgSO4·7H2O，0.5g／L；CaCl2，0.02g／L；瀝青質(zhì)，7g／L；調(diào)節(jié)pH 值至7.

固體 培 養(yǎng) 基：葡 萄 糖，3.0g／L；蛋 白 胨，3.0g／L；酵母浸粉，3.0g／L；NaCl，5.0g／L；K2HPO4，2.7g／L；瓊脂，20g／L；調(diào)節(jié)pH 值至7.

取10mL某稠油油田采出水于富集培養(yǎng)基內(nèi)，37℃，160r／min振蕩培養(yǎng)14d后，將培養(yǎng)液在固體培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線分離，對(duì)作用前后的瀝青質(zhì)進(jìn)行紅外光譜和相對(duì)分子質(zhì)量分析.

其中，稠油瀝青質(zhì)的提取及其稠油族組分含量測定，采用中華人民共和國石油天然氣行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SY／T 5119—1995[6]進(jìn)行；紅外光譜圖采用尼高力IR200紅外光譜儀測定；瀝青質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量采用蒸氣壓滲透法測定.

1.2.2 瀝青質(zhì)降解菌的分子生物學(xué)鑒定

菌株16SrDNA測序：從固體平板上挑取少量菌體，用無菌水洗滌3次，離心取沉淀，稀釋液體作為模板，引物為細(xì)菌16SrDNA的PCR通用引物（27F，1492R），使 用 TIANGEN 公 司 生 產(chǎn) 的Taqmix體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增.擴(kuò)增產(chǎn)物送大連寶生物公司測序，將測序結(jié)果用BLAST與GenBank中的16SrDNA序列進(jìn)行同源性比較.

1.2.3 瀝青質(zhì)降解菌的稠油作用評(píng)價(jià)

評(píng)價(jià)培養(yǎng)基：NH4NO3，1.0g／L；K2HPO4，1.5 g／L；KH2PO4，0.5g／L；MgSO4·7H2O，0.5g／L；CaCl2，0.02g／L；稠油，10g／L；調(diào)節(jié)pH 值至7.

將活化的瀝青質(zhì)降解菌的種子液按1%接種量接入評(píng)價(jià)培養(yǎng)基內(nèi)，37℃，160r／min振蕩培養(yǎng)14 d，同時(shí)將不接菌的評(píng)價(jià)培養(yǎng)基在相同條件下培養(yǎng)，作為空白對(duì)照，對(duì)比兩者的稠油外觀、族組分、紅外光譜、支化指數(shù)、密度及黏度的差異.

其中，稠油核磁共振譜圖采用Bruker AVANCE 500Hz 500MHz超導(dǎo)核磁共振儀測定；稠油黏度采用中華人民共和國石油天然氣行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SY／T 7549—2000測定；稠油密度采用煤油稀釋法測定[8].

2 結(jié)果分析

2.1 瀝青質(zhì)降解菌S的篩選與鑒定

通過分離純化，得到一株能以瀝青質(zhì)為唯一碳源生長的菌株S.對(duì)菌株S進(jìn)行革蘭氏染色表明，菌株S為革蘭氏陽性菌，短桿狀.利用細(xì)菌16SrDNA通用引物擴(kuò)增菌株S的16SrDNA部分片段，將其序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育對(duì)比，序列分析顯示菌株S與Bacillus屬的已確定的種的相似度為94%～99%，其中與BacillussubtilisBSn5的相似度最高，達(dá)到99%.系統(tǒng)發(fā)育樹用MEGA 3.1軟件建立，如圖1所示，顯示菌株S屬于Bacillus屬.

圖1 菌株S的16SrDNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.1 Phylogenetic analysis of 16SrDNA sequence of strain S

菌株S作用前后瀝青質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量的測定結(jié)果見表1.菌株S作用后瀝青質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量降低，與作用前相比降幅達(dá)5.9%.

表1 菌株S對(duì)瀝青質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的影響Tab.1 Molecular weight change of asphaltene before and after biodegradation by strain S

菌株S作用前和作用后的瀝青質(zhì)紅外譜分析結(jié)果如圖2所示.

圖2 菌株S對(duì)瀝青質(zhì)紅外譜圖的影響Fig.2 FTIR spectrum of asphaltene by strain S

從圖2可以看出，與作用前相比，菌株S作用后瀝青質(zhì)在3 396cm－1處吸收峰銳減，該峰屬于分子間氫鍵多聚締合的譜峰，表明菌株S作用后重質(zhì)組分之間相互締合的程度降低；在2 800～3 000cm－1處吸收峰增強(qiáng)，該峰是由于環(huán)烷烴和烷烴C－H振動(dòng)產(chǎn)生的結(jié)果，表明瀝青質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)更趨于飽和；1 600cm－1處吸收峰減弱，該峰是苯環(huán)吸收峰，表明瀝青質(zhì)中芳香類結(jié)構(gòu)減少；1 032cm－1處吸收峰略有增加，該峰是C－O鍵吸收峰，表明產(chǎn)生了氧化性產(chǎn)物.根據(jù)以上分析推測，菌株S通過對(duì)瀝青質(zhì)的氧化作用，一方面降低重質(zhì)組分之間相互締合的程度，另一方面減少芳香類結(jié)構(gòu)，使瀝青質(zhì)的飽和程度增加.

2.2 菌株S對(duì)稠油作用效果評(píng)價(jià)

2.2.1 稠油外觀變化

經(jīng)過14d的培養(yǎng)后，空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)樣品中的稠油的外觀沒有變化，仍然呈現(xiàn)聚集狀態(tài).與空白對(duì)照相比，接入菌株S的實(shí)驗(yàn)樣品中的稠油在菌株S的作用下發(fā)生了明顯的乳化現(xiàn)象，并由最初的聚集狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)小顆粒狀[9].稠油的表觀變化說明菌株S對(duì)稠油具有良好的乳化效果，如圖3所示.

圖3 空白對(duì)照與經(jīng)菌株S作用后稠油的表觀變化圖Fig.3 The apparent change of heavy oil before and after biodegradation by strain S

2.2.2 稠油紅外光譜變化

培養(yǎng)14d后，分別取出空白對(duì)照及經(jīng)菌株S作用后的稠油，進(jìn)行紅外光譜分析，譜圖如圖4所示.

從譜圖可以發(fā)現(xiàn)，在2 800～3 000cm－1處稠油的紅外光譜出現(xiàn)很強(qiáng)的吸收峰，這些強(qiáng)的吸收峰是環(huán)烷烴和烷烴C－H振動(dòng)的結(jié)果，其中以2 923 cm－1和2 852cm－1的－CH2－的吸收最強(qiáng).1 455 cm－1和1 372cm－1附近均顯示出明顯的脂肪烴甲基和亞甲基的面內(nèi)伸縮振動(dòng)吸收峰.而1 455cm－1和1 598cm－1出現(xiàn)相對(duì)強(qiáng)峰可以表明該化合物中含有芳核結(jié)構(gòu).

對(duì)比空白對(duì)照樣與經(jīng)菌株S作用后的稠油紅外光譜圖的變化可看出，經(jīng)菌株S作用后稠油在3 450 cm－1處譜峰明顯減弱，該峰屬于分子間氫鍵多聚締合的譜峰，表明菌株S作用后重質(zhì)組分之間相互締合的程度降低.從譜峰含量上來看2 800～3 000 cm－1，2 922cm－1和2 852cm－1處譜峰都有不同程度增加，可以認(rèn)為減弱的重質(zhì)組分相應(yīng)轉(zhuǎn)化為飽和組分及芳香組分.

圖4 空白對(duì)照與經(jīng)菌株S作用后稠油的紅外光譜圖Fig.4 FTIR spectrum of heavy oil before and after biodegradation by strain S

2.2.3 稠油支化指數(shù)變化

核磁共振波譜廣泛用于有機(jī)化合物及其混合物的結(jié)構(gòu)分析，1H－NMR（核磁共振氫譜）可以很清楚地區(qū)分與芳香碳相連的氫以及與飽和碳相連的氫.石油烴的支化指數(shù)（BI）是指其中碳鏈的分支程度[10].

式中：Hβ為芳香環(huán)β碳上的氫以及β位以遠(yuǎn)的CH2和CH基上的氫原子數(shù)；Hγ為芳香環(huán)的γ位以及γ位以遠(yuǎn)的CH3基上的氫原子數(shù).

對(duì)菌株S作用后的稠油樣品和未添加菌株S的空白對(duì)照樣品利用核磁共振進(jìn)行了檢測，對(duì)比譜圖發(fā)現(xiàn)2個(gè)樣品的譜圖具有明顯差異；而未添加S的樣品在培養(yǎng)前后無明顯差異，因此，僅給出空白和菌株S作用后的稠油核磁共振譜圖（如圖5所示）.根據(jù)譜圖得到不同稠油樣品相應(yīng)的支化指數(shù)，見表2.

從表2中數(shù)據(jù)可看出，稠油經(jīng)菌株S作用后樣品支化指數(shù)升高，這可能是由于稠油中瀝青質(zhì)含量相對(duì)高，而瀝青質(zhì)是以稠合芳香環(huán)系為核心，經(jīng)菌株S作用后，其芳香環(huán)發(fā)生斷鏈開環(huán)作用，導(dǎo)致與芳香環(huán)相連的支鏈增多.

圖5 空白對(duì)照與經(jīng)菌株S作用后的稠油核磁共振譜圖Fig.5 NMR spectrum of heavy oil before and after biodegradation by strain S

表2 菌株S對(duì)原油的支化指數(shù)的影響Tab.2 Influence of biodegradation on branching index of heavy oil by strain S

2.2.4 稠油族組分變化

測試了菌株S作用前后稠油樣品的族組分變化.添加菌株S培養(yǎng)14d后，稠油組分中的芳香烴含量增加最高，烷烴次之，而瀝青質(zhì)含量則大幅度降低，其瀝青質(zhì)降解率達(dá)到了34.87%.而未添加菌株S的空白對(duì)照在培養(yǎng)前后稠油組分沒有明顯變化，見表3.這是由于菌株S主要是作用于稠油中的瀝青質(zhì)，使瀝青質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，相應(yīng)轉(zhuǎn)化為其他組分，從而改變了稠油族組分的結(jié)構(gòu)組成.瀝青質(zhì)是影響稠油黏度的主要因素之一，它的減少會(huì)使稠油黏度降低[11]，從而增加稠油流動(dòng)性

2.2.5 稠油黏度與密度變化

通過對(duì)菌株S作用前后稠油黏度及密度的測定發(fā)現(xiàn)，添加菌株S培養(yǎng)14d后，稠油的黏度和密度都有不同程度的降低.而未添加菌株S的空白對(duì)照在培養(yǎng)前后稠油組分沒有明顯變化，見表4.

表3 菌株S對(duì)稠油族組分的影響Tab.3 Influence of biodegradation on composition of heavy oil by strain S %

表4 菌株S對(duì)稠油黏度、密度的影響Tab.4 Influence of biodegradation on viscosity and density of heavy oil by strain S

加入菌株S作用后，稠油的黏度、密度均降低.稠油黏度由作用前的3 576mPa·s降低至2 356 mPa·s，降黏率達(dá)到34.11%.稠油密度從作用前的0.997 3g·cm3降低至0.951 7g·cm－3，降幅達(dá)到4.57%.由此可看出，菌株S在一定程度上改變了稠油的物性.

3 結(jié) 論

1）通過一系列篩選實(shí)驗(yàn)，得到一株能以稠油瀝青質(zhì)為唯一碳源生長的菌株S，分子生物學(xué)分析結(jié)果表明，菌株S屬于Bacillus屬，與BacillussubtilisBsn5的序列相似度達(dá)99%.

2）菌株S以瀝青質(zhì)唯一碳源，在有氧條件下利用氧化作用，一方面降低重質(zhì)組分之間相互締合的程度，另一方面減少芳香類結(jié)構(gòu)，使瀝青質(zhì)的飽和程度增加.菌株S作用后，瀝青質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量降低5.9%.

3）菌株S能改變稠油組分，其作用稠油后可以導(dǎo)致組分中瀝青質(zhì)含量降低及烷烴含量相應(yīng)升高.

4）稠油經(jīng)菌株S作用后，黏度和密度均出現(xiàn)不同幅度的降低，作用14d的降黏率達(dá)34.11%，密度降低了4.57%，物性得到明顯改善，表明菌株S在稠油的微生物開采和改質(zhì)應(yīng)用方面具有一定潛力.

[1] 孔淑瓊，魏力，佘躍惠，等.渤海稠油的微生物降解特性[J].油田化學(xué)，2009，26（4）：432－435.KONG Shu－qiong，WEI Li，SHE Yue－h(huán)ui，etal.Microbial degradability of Bohai heavy oils [J].Oilfield Chemistry，2009，26（4）：432－435.（In Chinese）

[2] 王春明，李大平，劉世貴.稠油開采微生物的生理生化特征及其對(duì)原油特性的影響[J].石油學(xué)報(bào)，2007，28（5）：89－92.WANG Chun－ming，LI Da－ping，LIU Shi－gui.Effects of biophysiological and biochemical characteristics of a strain ofmicrobacteriumsp.on properties of thickened oil[J].Acta Petrolei Sinica，2007，28（5）：89－92.（In Chinese）

[3] BATZLE M，HOFMANN R，HAN D H.Heavy oils seismic properties[J].The Leading Edge，2006，25（6）：750－756.

[4] 李季，元艷，陳棟.塔河超稠油膠質(zhì)＼瀝青質(zhì)形貌分析[J].石油與天然氣化工，2010，39（5）：454－456.LI Ji，YUAN Yan，CHEN Dong.Morphology analysis of resin and asphaltene[J].Chemical Engineering of Oil ＆ Gas，2010，39（5）：454－456.（In Chinese）

[5] 王曉宇，宋天民.稠油降粘方法研究現(xiàn)狀[J].河北化工，2009，32（11）：27－29.WANG Xiao－yu，SONG Tian－min.Heavy oil viscosity methods[J].Hebei Chemical Engineering and Industry，2009，32（11）：27－29.（In Chinese）

[6] 孟科全，唐曉東，鄒雯炆，等.稠油降粘技術(shù)研究進(jìn)展[J].天然氣與石油，2009，27（3）：30－34.MENG Ke－quan，TANG Xiao－dong，CUI Wen－wen，etal.Progress in research on heavy oil viscosity reduction technology[J].Oil ＆ Gas Treating and Processing，2009，27（3）：30－34.（In Chinese）

[7] 陳棟，李季，黃燕山，等.膠質(zhì)和瀝青質(zhì)對(duì)原油流動(dòng)性影響的紅外光譜研究[J].應(yīng)用化工，2010，39（7）：1100－1104.CHEN Dong，LI Ji，HUANG Yan－shan，etal.Influence of the colloid and asphaltene on fluidity of the crude oil by IR spectrum [J].Applied Chemical Industry，2010，39（7）：1100－1104.（In Chinese）

[8] 陳春明.煤油稀釋（密度計(jì)）法測定泡沫稠油密度[J].吐哈油氣，2009，14（4）：361－363.CHEN Chun－ming.Using kerosene dilution （Densimeter）method to determine foam heavy oil density[J].Tuha Oil ＆Gas，2009，14（4）：361－363.（In Chinese）

[9] 易紹金，鄧勇.產(chǎn)表面活性劑菌在稠油乳化降粘中的實(shí)驗(yàn)研究[J].石油與天然氣化工，2008，37（1）：59－61.YI Shao－jin，DENG Yong.Experimental study of surfactant producing bacteria in emulsifying and visbreaking viscous oil[J].Chemical Engineering of Oil ＆ Gas，2008，37（1）：59－61.（In Chinese）

[10] 梁文杰.石油化學(xué)[M].東營：中國石油大學(xué)出版社，1996：52－54.LIANG Wen－jie.Petrochemistry[M].Dongying：China's Oil University Press，1996：52－54.（In Chinese）

[11] 汪雙清，沈斌，林壬子.稠油黏度與化學(xué)組成的關(guān)系[J].石油學(xué)報(bào)：石油加工，2010，26（5）：795－799.WANG Shuang－qing，SHEN Bin，LIN Ren－zi.Correlation for the viscosity of heavy oil and its chemical composition [J].ACTA Petrolei Sinica：Petroleum Processing Section，2010，26（5）：795－799.（In Chinese）