巨細(xì)胞病毒感染小鼠結(jié)腸中腸三葉因子的表達(dá)及更昔洛韋的干預(yù)作用＊

劉 芹，王 軍，葉黎離，鄭玉艷，劉文強(qiáng)，楊倩倩

（徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，江蘇徐州 221000）

人巨細(xì)胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）屬于皰疹病毒亞科，是導(dǎo)致胃腸道感染的常見病原體［1］。在發(fā)展中國家，高達(dá)80%的兒童在3歲前就已經(jīng)感染HCMV。HCMV結(jié)腸炎患者的結(jié)腸內(nèi)可見的大面積的潰瘍，患者因久治不愈會造成中毒性結(jié)腸擴(kuò)張、腸穿孔、腸息肉、腸癌、腸狹窄和腸梗阻等，甚至危及生命［2］。CMV具有嚴(yán)格的種屬特異性，但鼠巨細(xì)胞病毒（murine cytomegalovirus，MCMV）和HCMV在基因及核酸水平有很多相似性［3］，為本研究CMV感染機(jī)制提供了依據(jù)。腸三葉因子（intestinal trefoil factor，ITF／TFF3）屬于三葉因子家族肽［4］，是一類較新的腸黏膜保護(hù)因子，在腸黏膜的保護(hù)和損傷修復(fù)中發(fā)揮重要作用。它既能與黏液糖蛋白結(jié)合成凝膠，增強(qiáng)黏膜防御功能，又可以促上皮細(xì)胞移動，加速損傷修復(fù)，保持腸黏膜完整，從而限制了組織流動，電解質(zhì)丟失，減輕了免疫所致的腸道炎癥反應(yīng)［5－7］。本文參照文獻(xiàn)［8］建立小鼠CMV感染模型。并在其基礎(chǔ)上研究ITF的表達(dá)情況，探討ITF在MCMV感染中的作用。

1 材料與方法

1.1 病毒和細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠NIH／3T3細(xì)胞及MCMV Smith毒株由山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物研究所提供。小鼠NIH／3T3細(xì)胞按常規(guī)方法培養(yǎng)傳代［8］。MCMV Smith毒株小鼠體內(nèi)傳毒健康純系BALB／c小鼠（購自徐州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗動物中心，飼養(yǎng)在徐州醫(yī)學(xué)院動物室清潔層柜內(nèi)），雌性，6～8周齡，體質(zhì)量18～22g。甲基潑尼松龍注射液每只2mg，每4天肌內(nèi)注射1次；第1次藥物注射后第2天每只小鼠腹腔接種105.31／mL PFU MCMV Smith病毒懸液；病毒接種后第14天用眼球摘除法處死小鼠取唾液腺；每個唾液腺用無血Dubecco MEM Eagle培養(yǎng)液1mL充分勻漿；離心取上清分裝，置－80℃冰箱保存待用。測定病毒致半數(shù)細(xì)胞感染量TCID50＝105.31／mL。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗動物模型制備及分組 雌性BALB／c，4周齡，體質(zhì)量8～12g，采用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒檢測MCMV IgM、IgG，MCMV IgM、IgG均陰性者判斷為無 MCMV感染，納入研究。在12／12h晝夜循環(huán)條件下自由進(jìn)食，實(shí)驗前適應(yīng)1周。實(shí)驗動物隨機(jī)分為空白組、病毒組和更昔洛韋（ganciclovir，GCV）組，每組8只小鼠，小鼠腹腔接種含病毒105.31／mL的病毒液100μL，建立播散型MCMV感染小鼠模型，自病毒接種后24h為0d，GCV組在接種病毒懸液24h后給予GCV（國藥準(zhǔn)字：H111101－1，湖北科益藥業(yè)有限公司）50mg／kg腹腔注射每日1次，14d，同時空白組和病毒組在相應(yīng)時間點(diǎn)分別給予同等劑量的生理鹽水。實(shí)驗小鼠分別于第3、7、14天處死后取出肝臟、結(jié)腸放于4℃預(yù)冷的無RNA酶的凍存管中，液氮保存。

1.2.2 MCMV－DNA PCR檢測 購買天根公司DNA提取試劑盒（目錄號為DP304），提取DNA后于紫外分光光度計下測定A260／A280，穩(wěn)定1.8～2.0為可用，－20℃保存?zhèn)溆谩Ｒ镉缮虾Ｉど锕こ逃邢薰竞铣?。上游引物?′－TCA GCC ATC AAC TCT GCT ACC AAC－3′，下游引物：5′－ATC TGA AAC AGC CGT ATA TCA TCT TG－3′產(chǎn)物長度為100 bp，退火溫度為59℃。PCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，紫外線燈下觀察有無MCMV－DNA電泳條帶。

1.2.3 總RNA提取 采用異硫氰酸胍－酚－氯仿一步法提取總RNA，于紫外分光光度計下測定A260／A280，穩(wěn)定于1.8～2.0為可用，－80℃保存?zhèn)溆?。引物設(shè)計及合成，均由上海生工生物工程有限公司合成。ITF序列如下，正義引物：5′－ACA ACC CTG CTG CTT GGT CCT －3，反義引物：5′－TCT GTC TCT TGC AGA GGT TTG－3′；擴(kuò)增片段為：212bp，退火溫度為59℃。內(nèi)參序列鼠甘油醛－3－磷酸脫氫酶（GAPDH），正義引物：5′－CCA AAA GGG TCA TCA TCT CC－3′，反義引物：5′－CAA CCT GGT CCT CAG TGT AGC－3′，擴(kuò)增片段：498 bp，退火溫度為58℃。實(shí)時定量逆轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈反應(yīng)（RTPCR）以RT－PCR二步法進(jìn)行ITF mRNA檢測，PCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，采用凝膠成像分析系統(tǒng)（GIS－2008型，上海天能科技有限公司）進(jìn)行吸光度掃描分析，結(jié)果以ITF mRNA擴(kuò)增條帶與GAPDH內(nèi)參擴(kuò)增條帶的掃描峰面積比值表示mRNA的相對含量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料用表示，多組間比較采用單因素方差分析（One－Way ANOVA），組間兩兩比較采用q檢驗，檢驗水準(zhǔn)α＝0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 生長發(fā)育情況 病毒組小鼠出現(xiàn)食欲差、活動少；皮毛稀松、對刺激反應(yīng)遲鈍、生長遲緩、體質(zhì)量不增等表現(xiàn)。

2.2 PCR檢測結(jié)果 病毒組肝臟、結(jié)腸組織 MCMV－DNA PCR電泳可見陽性條帶，空白組無陽性條帶，GCV組亦可見陽性條帶，但和病毒組比較明顯變暗、模糊。見圖1、2。

圖1 肝臟組織MCMV－DNA PCR結(jié)果

2.3 各組小鼠結(jié)腸黏膜ITF的表達(dá)比較 空白組ITF mRNA表達(dá)量在3、7和14d時類似；病毒組在3d時增加，14d時達(dá)高峰，3個時間點(diǎn)表達(dá)量差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；GCV組在3d時開始增加，14d時達(dá)高峰，3個時間點(diǎn)表達(dá)量差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。7、14d時，GCV組ITF mRNA表達(dá)量高于病毒組和空白組（P＜0.05），3、7、14d時，病毒組高于空白組（P＜0.05）。見圖3、表1。

圖2 結(jié)腸組織MCMV－DNA PCR結(jié)果

圖3 結(jié)腸組織ITF RT－PCR結(jié)果

表1 實(shí)驗小鼠ITF表達(dá)的比較（，n＝8）

表1 實(shí)驗小鼠ITF表達(dá)的比較（，n＝8）

a：P＜0.05，與病毒組和 GCV組比較；b：P＜0.05，與病毒組比較；c：P＜0.05，與同組7、14d時比較。

組別3d 7d 14d空白組 0.930±0.051a0.950±0.056a1.050±0.072a病毒組 0.970±0.041c 1.120±0.0751.360±0.085 GCV組 1.250±0.110c 1.450±0.120b 1.700±0.140b

3 討 論

巨細(xì)胞病毒屬于皰疹病毒家族中的一員，成人的感染率在40%～100%。大部分感染并沒有臨床癥狀出現(xiàn)，通常有終身的潛伏期，但CMV感染能夠引起嚴(yán)重的胃腸道疾病。臨床上嚴(yán)重的胃腸道CMV疾病通常發(fā)生在免疫受損的患者中［9］，在免疫正常人群中感染很少報道。CMV感染可使炎癥性腸病患者病情更加復(fù)雜，導(dǎo)致重癥率和死亡率升高［10］。

ITF通過疏水鍵同黏液糖蛋白（mucin，MUC）結(jié)合，形成穩(wěn)定的凝膠復(fù)合物，此凝膠復(fù)合物可以抵抗胃腸道胃酸、蛋白酶和機(jī)械損傷等，從而增強(qiáng)了胃腸道黏膜屏障的防御能力，并能促進(jìn)上皮細(xì)胞向損傷處的遷移［11］。細(xì)胞遷移是黏膜受損后早期修復(fù)的關(guān)鍵過程，損傷區(qū)域周邊細(xì)胞遷移到損傷部位，重建上皮的完整性和黏膜屏障。Vandenbroucke等［12］在口服硫酸葡聚糖誘導(dǎo)腸道炎癥的實(shí)驗中發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗組予胃飼有生物活性的ITF，只發(fā)生輕度的上皮損傷；而對照組則死于廣泛性結(jié)腸炎，證實(shí)了ITF在維持黏膜屏障中的作用。組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)ITF基因剔除小鼠沒有早期修復(fù)過程，而給予重組ITF后，ITF基因剔除的小鼠能夠恢復(fù)正常的黏膜修復(fù)功能［13］。大量實(shí)驗證明，ITF在胃腸道中的保護(hù)和修復(fù)過程中發(fā)揮重要的作用。

腸道HCMV感染主要出現(xiàn)于免疫功能低下的人群如艾滋病患者、器官移植患者、惡性腫瘤患者及炎癥性腸炎患者等，但CMV感染后能否導(dǎo)致人體免疫功能的進(jìn)一步損傷尚未得到證實(shí)。本研究發(fā)現(xiàn)，4周齡小鼠接種MCMV后出現(xiàn)生長發(fā)育減緩，體質(zhì)量減低，與空白組相比，病毒組結(jié)腸組織ITF蛋白表達(dá)升高。提示MCMV造模后3d，小鼠結(jié)腸黏膜可能處于修復(fù)早期，ITF的表達(dá)有上調(diào)的趨勢。與病毒組相比，GCV組結(jié)腸組織中ITF表達(dá)明顯升高，提示GCV在CMV腸道感染中的治療作用可能是通過上調(diào)ITF基因表達(dá)，促進(jìn)受損區(qū)域上皮細(xì)胞的重建，可能是藥物發(fā)揮黏膜修復(fù)重建作用的機(jī)制之一。

綜上所述，ITF在CMV感染腸道的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用，這也為CMV的發(fā)病機(jī)制研究及其臨床治療提供了一個新方向。引用外源性ITF或者提升ITF活性可能成為治療CMV感染的新靶點(diǎn)。

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