五種食用菌子實體凝集素的篩選及部分生物學(xué)活性的比較

王戴 歐陽亮 王文穎

（1.青海師范大學(xué)，青海 西寧 810008；2.上海邦成生物科技有限公司，上海 200231）

凝集素是一類具有糖結(jié)合專一性、可促使細胞凝集的蛋白質(zhì)或糖蛋白，廣泛存在于動物、植物和微生物中。近十幾年來，凝集素的研究、應(yīng)用方興未艾[1]。隨著靈芝、金針菇和口蘑等食用菌凝集素及其抗腫瘤效果的相繼發(fā)現(xiàn)，人們逐漸認識到真菌凝集素的重要作用[2-3]。除了含有豐富的維生素，氨基酸，多糖等營養(yǎng)成分外，約有30%～50%的食（藥）用菌中都含有具有一定生物學(xué)功能的凝集素。

近年來，已發(fā)現(xiàn)和研究的食用菌凝集素的數(shù)量增長可觀，迄今為止全世界僅有大約50多種藥用真菌凝集素被純化[4]，但相對于數(shù)量巨大的蘑菇凝集素來說，目前被研究人員已分離純化和進行性質(zhì)研究的只是一小部分，仍有很多凝集素有待開發(fā)利用。對許多食用菌作用機理也需要進一步深化研究，為其應(yīng)用提供可靠的科學(xué)依據(jù)。

本研究采用東北地區(qū)常見的5種食用菌：白平菇、吉猴頭、灰平菇、雞腿菇、滑菇子實體篩選凝集素，其結(jié)果將對闡明凝集素在大型蕈菌中的分布及其生物學(xué)特性提供有意義的基礎(chǔ)資料。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株

猴頭菌（H.erinaceus）、滑菇(P.nameko)、雞腿菇(C.comatus)、灰平菇(P.ostreatus)、白平菇（P.lignatilis）、大腸桿菌（E.coli）、金黃色葡萄球菌（S.aureus）、枯草芽孢桿菌（B. subtilis）釀酒酵母菌（S.cererisiae）由齊齊哈爾大學(xué)微生物教研室保存。

1.1.2 生化試劑

硫酸銨，聚乙二醇2000，乳糖，D-果糖，D-葡萄糖，蔗糖，阿拉伯糖，麥芽糖，無水碳酸鈉，檸檬酸三鈉，磷酸二氫鈉，磷酸氫二鈉，乙二胺四乙酸二鈉，牛肉浸膏，蛋白胨，牛血清白蛋白均為國產(chǎn)分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 凝集素的分離和提取

稱取烘干的食用菌子實體干品，剪碎后用4倍體積（w/v）0.85%生理鹽水4℃浸提24h，用組織搗碎機搗碎成勻漿。按文獻[5]的提取方法，得粗凝集素。

1.2.2 2%血細胞樣品的制備

取人的A型、B型、AB型、O型血及家兔、雞、蛤蟆等7種新鮮血以9：1的量加入3.8%的檸檬酸鈉，用0.9%的生理鹽水反復(fù)洗滌2～3次，每次2000rpm離心5min，棄上清，按紅細胞體積比配成2%（v/v）的血細胞懸浮液。

1.2.3 紅細胞凝集實驗

在96孔“V”型血凝板中加入凝集素樣品25μL，用PBS（pH7.4）系列倍比稀釋；每孔加入25μL 2%血細胞懸液，室溫放置2hr后觀察凝集結(jié)果，有顯著凝集現(xiàn)象的最高稀釋度孔的稀釋倍數(shù)，判定為該樣品的凝集效價，記錄為2n。以PBS（pH7.4）作空白對照。

1.2.4 凝集素?zé)岱€(wěn)定性的測定

參照文獻[5]的方法，設(shè)置溫度為30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃。

1.2.5 pH值對凝集素的凝集活力的影響實驗

使用梯度pH緩沖液：pH2.6～7.0磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液；pH7.38～8.34磷酸氫二鈉-磷酸氫二鉀緩沖液；pH8.6～10.0甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液。

在96孔V型血凝板上加45μL凝集素溶液與等體積的緩沖液進行倍比稀釋后，加入等體積的2%的紅細胞懸液，振勻。室溫下放置1hr后用顯微鏡進行檢測。以緩沖液作空白對照。

1.2.6 糖抑制實驗

實驗用6種糖分別為乳糖（Lactose）、D-果糖（D-Fructose）、D-葡萄糖（D-Glucose）、蔗糖（Sucrose）、阿拉伯糖（Arabinose）、麥芽糖（Maltose），濃度均為2.5mg/mL。參照文獻[5]的方法，以糖液作空白對照。

1.2.7 金屬離子對凝集素的凝集活力的研究

取45μL樣品置于“V”型血凝板中并加入20mmol/L的EDTA，用2%（v/v）兔血細胞測定其凝集活力，對照樣不加EDTA。對于受EDTA抑制的凝集素分別補加0.01mol/L金屬離子（Fe3+、Mn2+、Cu2+、Zn2+、Ca2+、Mg2+、K+）溶液后，觀察是否恢復(fù)凝集活性。

2 實驗結(jié)果

2.1 血凝集活力

肉眼觀察，無凝集現(xiàn)象的紅細胞沉積在V型板呈大紅點，而有凝集現(xiàn)象時呈網(wǎng)狀且不下沉（見圖1）。

圖1 蕈菌對兔血細胞的凝集結(jié)果

以能發(fā)生凝聚作用的最低樣品濃度來表示各凝集素的效價, 對兔紅細胞的凝集活性，猴頭菌、白平菇、灰平菇、雞腿菇分別為滑菇對6種紅細胞均沒有活性。

2.2 溫度對凝集素凝集活力的影響

4種蕈菌粗蛋白在-20℃、4℃下放置近一個月，對兔紅細胞的凝集性仍然未變。但除雞腿菇外，對高溫處理的耐受性不如對堿性環(huán)境的耐受能力。

表1 溫度對蕈菌凝集素凝集活性的影響

2.3 酸堿度對凝集素凝集活力的影響

除雞腿蘑在pH≥10.0時失去凝集活力外，其余三種蕈菌都對堿性條件顯示了較強的耐受性，但四種蕈菌普遍對酸性環(huán)境缺乏耐受性。

2.4 糖抑制實驗結(jié)果

白平菇、雞腿蘑對兔血細胞的凝集不被供試的6種糖抑制；猴頭菇被除乳糖和蔗糖以外的4種糖所抑制；灰平菇則可被阿拉伯糖和麥芽糖外所抑制，結(jié)果見表2。

表2 不同糖對蕈菌凝集素凝集活性的影響

2.5 金屬離子對凝集活力的影響

20mmol/L EDTA作用之后，4種蕈菌中僅雞腿蘑凝集素不能被金屬螯合劑EDTA所抑制。猴頭菇在添加Mn2+、Cu2+、Zn2+這三種離子后恢復(fù)了凝集活力；白平菇在添加Mn2+、Cu2+、Zn2+、Ca2+這四種離子后恢復(fù)了凝集活力；灰平菇在添加Mn2+、Cu2+離子后恢復(fù)了凝集活力。

3 討論

根據(jù)本實驗觀測可知，滑菇中不含凝集素；猴頭菌、白平菇、灰平菇、雞腿菇對兔血細胞均有凝集作用，凝集活性由強到弱依次為雞腿菇凝集素>灰平菇凝集素>猴頭菇凝集素>白平菇凝集素。

4種凝集素都在30℃表現(xiàn)出最大凝集活性，這與其菌絲體生長的平均溫度較一致。雞腿菇是一種典型的中溫性土生菌，而其凝集素能夠耐受80℃高溫，推測可能原因在于1、雞腿菇凝集素活性位點主要為糖鏈，相對于肽鏈和蛋白質(zhì)對熱更不敏感；2、多肽中含有較多二硫鍵；3、這種蕈菌中含有多種大分子凝集活性物質(zhì)。劉艷如[6]在對雞腿菇、平菇凝集素耐熱性研究中發(fā)現(xiàn)，兩類凝集素粗提物的最高耐受溫度分別為60℃、40℃，而本研究檢測到的最高溫度分別是80℃、50℃。這與食用菌樣品來源有密切關(guān)系。

4種蕈菌在pH7.0～8.5之間表現(xiàn)出較強的凝集活性，這可能與蕈菌多為土生菌，生長環(huán)境中性偏堿有關(guān)，是一種適應(yīng)性反應(yīng)。白平菇、雞腿蘑凝集素可以和全部6種糖結(jié)合，推測這兩種蕈菌中可能含有結(jié)構(gòu)、成分各不相同的多種凝集物質(zhì)。

關(guān)于這幾種凝集素的成分、結(jié)構(gòu)、化學(xué)性質(zhì)及其它生物學(xué)活性，有待于作進一步研究。

[1]舒曉燕,阮期平,侯大斌.植物凝集素的研究進展[J].現(xiàn)代中藥研究與實踐,2006,20(6)：53-56.

[2]PatrickHK,Ngai,NgTB.Amushroom(Ganoderma capense)lectinwithspectacularthermostability,potentmitogenic activityonsplenocytes,andantiproliferativeactivitytowardtumor cells[J].BiochemBiophysResCommun,2004,314(4)：988-993.

[3]WangH,NgTB.Isolationandcharacterizationofvelutin,anovellowmolecularweightribosomeinactivatingproteinfrom wintermushroom(Flammulinavelutipes)fruitingbodies[J].Life Sci,2001,68(18)：2151-2158.

[4]吳恩奇,圖力古爾.蘑菇凝集素及其研究進展[J].菌物研究,2006,4(4)：69-76.

[5]王慶忠,張鷺,歐陽亮.14種蔬菜中凝集素的提取和生物活性研究[J].中國熱帶醫(yī)學(xué),2008,8(5)：749-783.

[6]劉艷如,余萍,鄭怡.12種食用菌凝集素的篩選[J].福建師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2003,19(2)：65-68.