59個油橄欖種質(zhì)的ISSR分子鑒定1)

陳海云 寧德魯 李勇杰 吳 濤 李 瑞 毛云玲 陳少瑜

(云南省林業(yè)科學院，昆明，650204) (云南省森林植物培育與開發(fā)利用重點實驗室(云南省林業(yè)科學院))

油橄欖(OleaeuyopaeaL.)，木犀科(Oleaceae)木犀欖屬(OleaLinn.)植物，是世界著名的亞熱帶常綠木本油料樹種之一，由于其高含量的不飽和脂肪酸(近90%)［1］，日趨受到廣大消費者的青睞。油橄欖原產(chǎn)于西亞和地中海地區(qū)，19世紀引種到美洲、澳洲和亞洲，從南半球的澳大利亞至北半球的蘇聯(lián)，許多國家都有分布［2］。油橄欖品種繁多，據(jù)統(tǒng)計，世界各地油橄欖自產(chǎn)品種共計1 275個，中國現(xiàn)有登記品種共158個［3］?？梢?，油橄欖的栽培歷史悠久，種質(zhì)資源豐富，其中包含大量的野生種、半野生種和栽培種，而且不同地域間品種交換頻繁，導致同名異物或同物異名的現(xiàn)象十分普遍。分子標記對品種的鑒定和分類，實質(zhì)上是直接在分子水平上對品種基因型的鑒定，其準確度高、效率高且信息量大［4］，目前已被廣泛應用于植物種質(zhì)資源鑒定、系譜關系分析等研究中。近年來，國外已有一些采用RAPD、AFLP、SSR和ISSR等分子標記技術進行油橄欖品種鑒定和遺傳多樣性研究的報道［5-9］。我國于1964年開始油橄欖的引種，之后開展了大量的栽培和品種選育等方面的研究［10］，但對于油橄欖種質(zhì)分子標記方面的研究還非常缺乏，僅見邱源等［11］采用RAPD技術對23個引種的油橄欖品種進行過分類和鑒定研究，以及馬萬里等［12］運用RAPD技術進行了澳大利亞油橄欖品種的鑒定研究等極少的報道。由此，本研究擬采用成本低、穩(wěn)定性高、操作簡單、重復性強的ISSR分子標記技術［13］對云南省永仁縣油橄欖品種資源收集圃中的59個油橄欖引種和選育品種進行遺傳多樣性和分子鑒定，為這些油橄欖品種資源的規(guī)范管理、進一步的科學研究和開發(fā)利用提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 材料

分析材料來源于收集種植在云南省楚雄州永仁縣油橄欖品種(種質(zhì))資源收集圃的59個油橄欖品種(表1)。其中：包括41個引種品種(1～41)，內(nèi)含品種名字相同，但引種來源地不同的12個品種(科拉蒂、配多靈、愛桑、米扎、皮瓜爾等);13個國內(nèi)選育品種(42～55);4個只有編碼代號和引種來源地品種(56～59)。以嫩葉為提取基因組DNA的材料。采集嫩葉后放入裝有硅膠的自封袋中，帶回實驗室置冰箱中-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 59個油橄欖品種原產(chǎn)地、來源及主要用途

1.2 基因組DNA的提取及ISSR－PCR擴增

采用植物基因組DNA提取試劑盒(Tiangen)提取59個油橄欖品種的基因組DNA，0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的DNA，具體方法見文獻［14］。以提取檢測后的基因組DNA為模板，進行ISSR引物(北京奧科鼎盛生物技術有限公司合成)篩選，篩選出擴增條帶清晰、多態(tài)性和重復性較高的引物用以ISSR分析。篩選出的清晰穩(wěn)定、多態(tài)性強的11條引物的序列、退火溫度見表2［14］。

擴增體系(20 μL)：1×TaqBuffer，3.5 mmol·L-1Mg2+，0.4 mmol·L-1dNTPs，1.0 μmol·L-1引物，1.0 UTaqDNA聚合酶，20 ng DNA模板;反應程序：94℃預變性5 min;94℃變性30 s，50～55℃退火30 s，72℃延伸2 min，40循環(huán);72℃延伸10 min，4℃保存。擴增產(chǎn)物于2.0%的瓊脂糖凝膠電泳，電泳緩沖液為0.5×TBE，電泳電壓為4 V/cm，電泳結(jié)束后在凝膠紫外成像儀上觀察、拍照。

表2 用以ISSR擴增的11條引物序列及退火溫度

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與遺傳分析

根據(jù)DNA Marker判讀電泳圖譜中擴增條帶的分子量大小及有無，同一位點有條帶的記為“1”，無條帶的記為“0”。采用Excel軟件對膠板樣本條帶進行轉(zhuǎn)化，構建0/1數(shù)據(jù)矩陣。以Excel軟件的數(shù)據(jù)記錄為基礎，利用DCFA1.1軟件將ISSR譜帶統(tǒng)計結(jié)果轉(zhuǎn)換為POPGENE軟件適用文件，由POPGENE32軟件獲得多態(tài)性位點及其百分數(shù)(PP，B)、基因的多樣性(H)及Shannon信息指數(shù)(I)等遺傳參數(shù)，根據(jù)POPGENE計算得到的Nei's遺傳距離和遺傳相似性系數(shù)，運用NTSYSpc 2.10軟件進行UPGMA法聚類分析，構建59個樣品親緣關系樹狀聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物擴增的多態(tài)性

用篩選出的11條ISSR引物對59個樣品進行擴增，擴增結(jié)果見表3。圖1為引物823和引物855對部分樣品的擴增圖譜。由表3可知，11條引物一共擴增出106條DNA譜帶，平均每條引物擴增9.63條帶。各條引物擴增的條帶數(shù)為3～16不等。擴增的條帶分布在300～2 600 bp之間，主要分布區(qū)間為500～1 500 bp。由擴增圖譜(圖1)可以直觀看到，所有樣品有相同的擴增位點，也有特異擴增位點，一定程度上說明所分析的油橄欖品種間的同源性，以及其遺傳背景的復雜性和多樣性，這些特異擴增位點也是各品種分子鑒別的依據(jù)。

圖1 引物823、855對部分油橄欖樣品的ISSR擴增圖譜

由表3可見，106個擴增位點中有99個為多態(tài)性位點，總的多態(tài)位點百分率為93.4%。其中：UBC-814、UBC-816、UBC-826 和 UBC-874 引物擴增產(chǎn)物的多態(tài)位點百分率皆為100%;引物UBC-852擴增的位點數(shù)最少，多態(tài)百分率也最低，僅有66.67%?；虻亩鄻有?H)為0.325 7;Shannon信息指數(shù)(I)為0.462 1?？梢?，云南永仁縣油橄欖品種資源收集圃中收集的油橄欖品種資源具備了較高的遺傳多樣性和豐富的遺傳基礎，為進一步的遺傳育種奠定了基礎。

表3 11個引物對59個品種的擴增結(jié)果

2.2 UPGMA聚類結(jié)果

根據(jù)POPGENE計算得到各品種的Nei's遺傳距離和遺傳相似性系數(shù)，運用NTSYSpc 2.10軟件進行UPGMA法聚類分析，構建59個品種親緣關系樹狀聚類圖(圖2)。圖2中以遺傳距離0.171處作一結(jié)合線，可以將所有59個品種分成4個大類：第Ⅰ類有6個品種，除引種自達州的奧托卡和米扎兩個引種品種外，其他4個品種皆為昆明本地選育的品種，包括3個雜交品種和1個親本;第Ⅱ大類只有切拉姆和米扎(廣元)2個品種;第Ⅲ大類由國內(nèi)選育和部分引種，共24個品種組成，而且大多引種自武都;第Ⅳ大類共有27個品種，其中21個為引種品種，主要來源于希臘和廣元，只有2個品種(城固31和城固32)為國內(nèi)選育的品種，還有4個只知編碼代號和引種來源地品種。

在遺傳距離0.154處的4個大類又可以分別分成若干亞類(圖2)。第Ⅰ大類可分為2個亞類Ⅰ-ⅰ和Ⅰ-ⅱ，每個亞類各包含了3個品種。第Ⅲ大類包含2個亞類：Ⅲ-ⅰ含有以國內(nèi)選育品種為主的13個品種，著名的果用品種阿斯和盧克斯被聚于此亞類中;Ⅲ-ⅱ含有以引種品種為主的11個品種。第Ⅳ大類被分為3個亞類：Ⅳ-ⅰ包含直接引種于希臘的4個品種柯基、柯基優(yōu)、貝翠麗-p、貝翠麗-t，以及引種自武都但原產(chǎn)地為法國的德坦彩;Ⅳ-ⅱ僅有莫約拉1個品種;Ⅳ-ⅲ亞類共有21個品種，其中15個為引種品種，主要來源于希臘和廣元，2個是國內(nèi)選育的品種(城固31和城固32);另外還含有4個未知身份的品種(M1～M4)。

2.3 親緣關系及分子鑒定

由POPGENE計算得到各品種的Nei's遺傳距離在0.1815～0.0178之間。在遺傳距離小于0.050之內(nèi)，豆果和豆果優(yōu)、M1和M3、柯基和柯基優(yōu)、貝翠麗-p和貝翠麗-t、配多靈(武)和配多靈(俞)、科拉蒂(武1)和科拉蒂(武2)、盧克斯和佛奧、雜交2號和雜交3號分別兩兩聚在一起，表明兩兩間的遺傳相似性較高，很有可能分別屬于同一品種，其中盧克斯和佛奧很有可能出現(xiàn)了同物異名;而名字相同、引種地不同的九峰(武都)和九峰(廣元)、愛桑(廣元)和愛桑(昆明)、米扎(廣元)和米扎(達州)以及皮瓜爾(希臘)和皮瓜爾(武都)卻兩兩分別聚在了不同的大類或亞類中，有可能出現(xiàn)了同名異物的現(xiàn)象;另外，引種自廣元的M1、M2、M3和M4聚在同一個亞類當中，它們也具有較高的遺傳相似性，有可能從同一品種選育或引種而來。

圖2 59個油橄欖品種的UPGMA聚類圖

3 結(jié)論與討論

用篩選出的11條ISSR引物對59個油橄欖品種種質(zhì)進行擴增，在全部106個擴增位點中有99個為多態(tài)性位點，總的多態(tài)位點百分率為93.40%，基因的多樣性為0.325 7;Shannon信息指數(shù)為0.462 1。表明油橄欖品種間的多態(tài)性比較高。這可能是廣泛的種質(zhì)起源以及漫長的進化和長期的人工選育的結(jié)果［15］，這一結(jié)果從分子水平上初步證明了油橄欖種質(zhì)廣泛和復雜的遺傳背景。另一方面，也揭示了云南永仁縣油橄欖品種資源收集圃中收集的油橄欖品種資源具備豐富的遺傳基礎，這些資源為進一步油橄欖種質(zhì)的開發(fā)和利用提供了物質(zhì)基礎。

基于各品種的遺傳距離，采用UPGMA法進行了59個品種的聚類，結(jié)果將59個品種聚成4個大類，其中第Ⅰ、第Ⅲ和第Ⅳ大類又分別分為若干亞類?？傮w上看，大多數(shù)引種品種并沒有按照地理起源(原產(chǎn)地)而更多是依據(jù)引種材料來源地和主要用途進行聚類：著名的果用品種超克、貝拉聚于Ⅳ-ⅲ亞類中，盧克斯和阿斯聚于Ⅲ-ⅰ亞類中;84.6%的國內(nèi)選育品種皆歸類于第Ⅰ和第Ⅲ大類中;引種品種則聚于Ⅱ、Ⅳ大類中?？梢?，在漫長的人類利用油橄欖種質(zhì)資源的過程中，由于廣泛、復雜的引種和選育，造成以生長、經(jīng)濟性狀、抗性等為主要目標的選擇壓力以及油橄欖種質(zhì)間頻繁的基因交流，進而導致這樣的聚類結(jié)果。這一結(jié)果與Besnard等［16］、Annalida 等［17］的研究結(jié)果相似，他們的研究結(jié)果表明，由于不同地域間頻繁的品種交換，導致劃分的類群與其地理起源沒有明顯的關系，而與果實的大小和用途明顯相關。

由于油橄欖的栽培歷史悠久，種質(zhì)資源豐富，資源引種的渠道較多，再加上長期的人工選育、管理不夠完善等因素，使得品種同名異物、同物異名的現(xiàn)象較為嚴重，給生產(chǎn)和科研帶來很多不便，從遺傳本質(zhì)上弄清楚所收集的種質(zhì)資源情況，對于更好地規(guī)范管理和利用這些資源具有非常重要的意義。正因為如此，國外有不少關于油橄欖品種分子鑒定的研究報道。比如：Terzopoulos等［18］對意大利栽培的31個油橄欖品種進行了ISSR分析，結(jié)果表明，ISSR標記在油橄欖品種中有較高的鑒定效率，可將供試品種完全區(qū)分開;Sanz-Cortés等［19］采用AFLP技術對10個西班牙品種進行鑒定，通過相似系數(shù)分析對其命名進行了更正。本研究基于ISSR標記的聚類結(jié)果表明，在所收集的59個油橄欖種質(zhì)中也存在同物異名和同名異物的現(xiàn)象，并進行了具體的分析。當然這只是一個方面的信息資料，如果能結(jié)合形態(tài)學特征和其他標記信息進行研究，則更能客觀和科學地鑒定和分類這些種質(zhì)資源，這也是下一步需要開展的工作。

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