金納米粒子摻雜DNA-CTMA-DPFP薄膜的表面增強(qiáng)拉曼散射特性

顏承恩，周 駿*，李 星，束 磊，馬亞楠

(1.寧波大學(xué)理學(xué)院光電子技術(shù)研究所，浙江寧波 315211;2.寧波大學(xué)材料科學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，浙江寧波 315211)

1 引 言

2001年，日本的Ogata小組從三文魚的卵和精囊中提取出了具有優(yōu)良光電特性的DNA材料[1]?；贒NA生物光子材料，人們開展了生物傳感器[2]、生物有機(jī)發(fā)光二極管[3]、有機(jī)場效應(yīng)晶體管[4]及熒光染料摻雜DNA-類脂生物材料的ASE特性的研究工作[5]。另一方面，貴金屬納米粒子局域表面等離子共振(LSPR)產(chǎn)生的電磁場增強(qiáng)效應(yīng)和表面增強(qiáng)拉曼散射(SERS)特性，在生物傳感領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景[6]。當(dāng)制備出間隙為納米尺寸大小的金納米陣列或者相同形狀的金納米粒子聚集成小簇時(shí)，同單個(gè)納米粒子相比，其局域電磁場增強(qiáng)的“熱點(diǎn)”作為SERS基底，能夠產(chǎn)生顯著的SERS響應(yīng)[7-12]。因此，近年來，根據(jù)貴金屬納米粒子和DNA生物光子材料的優(yōu)點(diǎn)，金納米粒子與DNA的結(jié)合體系，成為當(dāng)前材料學(xué)和生物光子學(xué)領(lǐng)域的重要研究對象[13]。例如，生物寡核苷酸能夠在三維空間定位納米粒子，寡核苷酸與金納米粒子的軛合物可以用于檢測DNA序列[14]。同樣，金納米粒子與熒光染料分子的混合體系，可用作光學(xué)和電子顯微鏡的標(biāo)記物檢測DNA或者蛋白質(zhì)的能量傳輸[15-16]。

本文利用水相還原法制備金納米粒子[17]，并通過離子交換法制備DNA-CTMA生物材料[5]，將金納米粒子與DNA-CTMA均勻摻雜，制備出金納米粒子摻雜DNA-CTMA材料。另外，利用鈀催化反應(yīng)合成 9，9-二乙基-2，7-二-(4-吡啶)芴(DPFP)熒光染料[18]與金納米粒子摻雜DNA-CTMA材料混合，制備出金納米粒子摻雜DNA-CTMA-DPFP材料，并甩膠制備成膜。分別測量金納米粒子摻雜與不摻雜的DNA-CTMA-DPFP薄膜樣品的吸收、熒光和拉曼光譜，研究了金納米粒子摻雜質(zhì)量比對DNA-CTMA-DPFP薄膜的SERS的影響。

2 材料制備及表征

2.1 材料與儀器

化學(xué)材料:氯金酸(99.9%)及鮭魚 DNA，十六烷基三甲基溴化銨(CTMA)(99%)，檸檬酸三鈉(99%)，9，9-二乙基-2，7-二溴芴，4-吡啶硼酸，碳酸鈉，四三苯基磷鈀，乙二醇二甲醚，二氯甲烷，石油醚，乙酸乙酯等，均為外購的分析純材料。自備去離子水的電阻率為18 MΩ·cm。

儀器:場發(fā)射掃描電子顯微鏡(SU-70，日本日立公司)、便攜式拉曼光譜儀(BWS415i-Raman TM，美國必達(dá)泰克公司)、雙光束紫外可見分光光度計(jì)(TU-1901，北京普析通用儀器有限公司)、熒光分光光度計(jì)(F-4500，日本日立公司)、高速冷凍離心機(jī)(TGL-20M，上海湘儀公司)、均膠機(jī)(SC-1B，北京創(chuàng)威納科技有限公司)、電熱板(EH35B，廣州市博泰科技儀器有限公司)。

2.2 金納米粒子摻雜DNA-CTMA材料的制備

首先采用檸檬酸三鈉法制備金納米粒子。取250 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01%的氯金酸水溶液，攪拌加熱至沸騰后，加入250 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的檸檬酸三鈉水溶液，保持沸騰，氯金酸水溶液顏色變成酒紅色，10 min后停止加熱，自然冷卻，即得到金納米粒子膠體溶液。

考慮到金納米粒子、CTMA以及DNA的相溶性，先在金納米粒子膠體溶液中加入1 g的CTMA粉末，再取250 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4%的DNA水溶液，將含CTMA的金納米粒子膠體溶液逐滴加入到DNA水溶液中。此時(shí)DNA和CTMA發(fā)生離子交換反應(yīng)，生成金納米粒子摻雜DNA-CTMA紫色沉淀物。室溫靜置8 h后，離心分離沉淀物，用去離子水沖洗沉淀物，去除雜質(zhì)并烘干，即得到金納米粒子摻雜DNA-CTMA粉末，金的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.725%。該材料可以溶于正丁醇、酒精等溶劑。

然后，分別配制200 mL質(zhì)量濃度為4 g/L的DNA水溶液和CTMA水溶液，將CTMA水溶液逐滴加入到DNA水溶液中，進(jìn)行離子交換反應(yīng)，室溫下靜置約6 h。離心分離出DNA-CTMA沉淀，用去離子水沖洗沉淀物，去除雜質(zhì)并烘干，得到干燥的DNA-CTMA白色粉末。

稱量100，98，96，94，92 mg 的 DNA-CTMA 材料，分別溶于2 mL的正丁醇溶液，磁力攪拌8 h，制備出5份DNA-CTMA正丁醇溶液，分別記為1#、2#、3#、4#、5#溶液。稱量 25 mg 金納米粒子摻雜的DNA-CTMA粉末溶于1 mL正丁醇溶液，并分別量取80，160，240，320 μL 該溶液，加入到2#、3#、4#、5#DNA-CTMA 正丁醇溶液中，制備成 4 種金納米粒子同DNA-CTMA質(zhì)量比為0.014 5%、0.029%、0.043 5%和 0.058%的金納米粒子摻雜DNA-CTMA正丁醇溶液。

2.3 金納米粒子摻雜DNA-CTMA-DPFP的材料制備

根據(jù)文獻(xiàn)[18]合成DPFP材料。首先取9，9-二乙基-2，7-二溴芴(1.14 g，3 mmol)、4-吡啶硼酸(0.93 g，7.5 mmol)、碳酸鈉(1.3 g，12 mmol)和四(三苯基磷)鈀(0.12 g，0.1 mmol)加入到 150 mL的兩頸圓底燒瓶中，抽真空充氮?dú)?次。然后將乙二醇二甲醚(80 mL)和水(40 mL)在氮?dú)獗Ｗo(hù)下加進(jìn)反應(yīng)瓶，混合溶液加熱至回流反應(yīng)48 h，冷卻至室溫，用二氯甲烷萃取，合并有機(jī)層，用大量的鹽水洗滌，無水硫酸鎂干燥3 h后濃縮得到粗產(chǎn)品。采用硅膠柱色譜 (V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=1∶2) 分離出 9，9-二乙基-2，7-二-(4-吡啶)芴(DPFP)，分子式為C27H24N2，相對分子量為376，結(jié)構(gòu)式如圖1所示，DPFP含有2個(gè)苯環(huán)、2個(gè)含氮雜環(huán)及2個(gè)乙基。

圖 1 9，9-二乙基-2，7-二-(4-吡啶)芴分子的結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Molecular structure of DPFP

稱量15 mg DPFP溶于15 mL正丁醇溶液中，超聲45 min。然后分別量取2 mL的染料正丁醇溶液加入1#DNA-CTMA 正丁醇溶液及2#、3#、4#、5#金納米粒子摻雜的DNA-CTMA正丁醇溶液中，磁力攪拌12 h后，將每份溶液濃縮到2 mL，得到1份DNA-CTMA-DPFP正丁醇溶液，4份金納米粒子摻雜的DNA-CTMA-DPFP正丁醇溶液。

2.4 薄膜樣品制備

以石英玻璃為襯底，旋凃以上5個(gè)樣品溶液，轉(zhuǎn)速1 000 r/min，時(shí)間 60 s，60 ℃下烘烤 8 h，即得到膜厚約為3 μm的DNA-CTMA-DPFP薄膜樣品和4種金納米粒子摻雜的DNA-CTMA-DPFP薄膜樣品，分別記為樣品1#～5#。在5種薄膜樣品中，DPFP分子的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為2%。

2.5 金納米粒子紫外可見吸收光譜和SEM形貌

分別用紫外可見分光光度計(jì)和場發(fā)射掃描電子顯微鏡觀測實(shí)驗(yàn)制備的金納米粒子膠體溶液的吸收光譜和SEM形貌，結(jié)果如圖2(a)、(b)所示。從圖2(a)可知，金納米粒子的局域表面等離子共振吸收峰位于532 nm;從圖2(b)可知，金納米粒子為球形，大部分納米粒子的粒徑為20 nm，呈均勻分布。球形金納米粒子的表面光學(xué)性質(zhì)各向同性，其局域表面等離子共振峰的形狀(半峰全寬FWHM)與粒子的粒徑分布有關(guān)，峰形比較對稱而且半峰全寬較窄，表明粒子的粒徑分布較均勻，與納米粒子的SEM圖結(jié)果相吻合。

圖2 金納米粒子的(a)吸收光譜和(b)電子掃描顯微鏡(SEM)圖Fig.2 Absorption spectrum(a)and Scanning electron microscope(SEM)imagine(b)of the gold nanoparticles

2.6 薄膜樣品紫外可見吸收和熒光光譜

用紫外-可見分光光度計(jì)和熒光光度計(jì)分別檢測薄膜樣品的吸收光譜和熒光光譜，結(jié)果如圖3(a)、(b)所示。

圖3 薄膜樣品的吸收光譜(a)及熒光光譜(b)Fig.3 Absorption spectra(a)and fluorescence spectra(b)of the film samples

從圖3(a)可見，5個(gè)樣品在300～360 nm的吸收來自芴類熒光染料DPFP[18]，其吸收峰強(qiáng)度與金摻雜質(zhì)量比有關(guān)，而樣品2#比樣品1#以及樣品5#比樣品4#的吸收峰強(qiáng)度小可能是膜厚誤差造成的。圖3(a)中的插圖是放大的5個(gè)樣品在450～700 nm之間的吸收光譜，樣品1#沒有吸收峰，樣品2#～5#存在明顯的吸收。對比圖2(a)發(fā)現(xiàn)，樣品2#～5#在500～700 nm之間的吸收來自于薄膜樣品中金納米粒子局域表面等離子共振吸收，并且隨金摻雜質(zhì)量比的增加而增強(qiáng)。從圖3(b)可知，樣品的熒光光譜位于350～475 nm的藍(lán)紫光區(qū)域，分別在370 nm和386 nm出現(xiàn)熒光峰，在408 nm處有不太明顯的一個(gè)肩峰，分別對應(yīng)DPFP的S10-S00、S10-S01和S10-S02能級的電子振動躍遷[18]。

3 拉曼光譜測量及結(jié)果分析

3.1 拉曼光譜測量的實(shí)驗(yàn)光路

采用顯微鏡采樣系統(tǒng)和拉曼探頭相結(jié)合的方式對薄膜樣品及DPFP和DNA-CTMA材料進(jìn)行拉曼光譜檢測。

圖4 拉曼檢測實(shí)驗(yàn)光路示意圖Fig.4 Experimental setup for Raman measurements

實(shí)驗(yàn)光路如圖4所示。來自拉曼光譜儀的激光光源，通過輸出光纖傳送到拉曼探頭，拉曼探頭與顯微采樣系統(tǒng)連接，經(jīng)顯微物鏡聚焦后照射在薄膜樣品上，再經(jīng)樣品反射后被物鏡采集并由光纖拉曼探頭傳輸至拉曼光譜儀進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)所用的拉曼激發(fā)光波長為785 nm，激光功率為48 mW，信號采集積分時(shí)間為10 s，掃描區(qū)間為500～2 700 cm－1。顯微鏡采樣系統(tǒng)中物鏡的放大倍率為40。測量過程中，將DPFP材料壓制成片狀，將薄膜樣品及壓制成片狀的DPFP及DNA-CTMA薄膜，分別放置于顯微鏡載物臺上，通過CCD視頻系統(tǒng)觀察照射光斑的大小，調(diào)節(jié)載物臺位置，使薄膜樣品位于物鏡的焦平面。

3.2 結(jié)果分析

實(shí)驗(yàn)測得的DPFP和DNA-CTMA及5種薄膜樣品的拉曼光譜如圖5(a)和圖5(b)所示。從圖5(a)可知，在785 nm激光激發(fā)下，DPFP在559，730，828，996，1 142，1 227，1 301，1 348，1 484，1 614 cm－1處出現(xiàn)拉曼散射峰。根據(jù)文獻(xiàn)[19]的分析，1 614 cm－1的拉曼散射峰為苯環(huán)的伸縮振動，1 142 cm－1的拉曼散射峰為C—H的彎曲振動，1 227 cm－1的拉曼散射峰為 C—N鍵伸縮振動，730 cm－1的拉曼散射峰為共軛環(huán)變形所引起，996 cm－1的拉曼散射峰與苯環(huán)取代有關(guān)。從圖5(a)還可知，DNA-CTMA 在 778，1 094，1 296 cm－1處出現(xiàn)拉曼散射峰。對 DPFP的拉曼光譜與DNA-CTMA的拉曼光譜進(jìn)行對比可知，在相同激發(fā)條件下，DPFP的拉曼光譜整體強(qiáng)度大于DNACTMA拉曼光譜，并且DPFP比DNA-CTMA的拉曼散射峰尖銳。從圖5(b)可知，5種薄膜樣品的拉曼光譜均存在熒光包絡(luò);樣品1#與樣品2#的拉曼光譜接近，沒有明顯的拉曼信號;樣品3#及樣品4#的拉曼光譜出現(xiàn)的特征峰不明顯;而樣品5#出現(xiàn)較強(qiáng)的拉曼散射峰，拉曼散射峰分別位于726，828，1 013，1 142，1 227，1 301，1 348，1 454，1 484，1 614 cm－1處。將樣品 5#的拉曼光譜同DPFP的拉曼光譜及DNA-CTMA的拉曼光譜進(jìn)行比較可知，樣品5#的拉曼光譜中主要拉曼散射峰與DPFP的拉曼光譜中的拉曼散射峰位置一致，說明樣品5#的拉曼信號主要由薄膜中的DPFP染料分子產(chǎn)生。

圖5 (a)DPFP和DNA-CTMA的拉曼光譜;(b)5種薄膜樣品的拉曼光譜。Fig.5 (a)Raman spectra of DPFP，DNA-CTMA.(b)Raman spectra of the five film samples.

同時(shí)，分析圖5(b)可知，在樣品1#的DNACTMA-DPFP體系中，摻雜質(zhì)量比為2%的DPFP均勻分散在DNA-CTMA中，在785 nm激光作用下，產(chǎn)生微弱的拉曼信號，淹沒在熒光光譜中，基本看不到拉曼散射峰信息。在金納米粒子摻雜DNA-CTMA-DPFP的4個(gè)樣品中，金納米粒子均勻分散在薄膜中，在785 nm激光作用下，DPFP分子激發(fā)出拉曼散射的同時(shí)也激發(fā)出熒光，而且隨著金納米粒子摻雜比的增大，DPFP分子的SERS效應(yīng)與熒光強(qiáng)度得到極大增強(qiáng)。這是由于在較高的金納米粒子摻雜比情況下，粒子之間的距離減小，粒子間隙處的電磁場超常增強(qiáng)，與金納米粒子發(fā)生作用的DPFP染料分子隨之增多，DPFP分子的熒光激發(fā)增強(qiáng)，同時(shí)較高的金納米粒子摻雜比使吸附在金納米粒子表面上的DPFP分子產(chǎn)生顯著的化學(xué)增強(qiáng)[20]，伴隨著表面拉曼散射效應(yīng)，表現(xiàn)出圖5(b)中樣品3#、4#、5#的增強(qiáng)拉曼光譜。

4 結(jié) 論

采用水相還原法和離子交換法及鈀催化反應(yīng)，制備了DNA-CTMA-DPFP材料和金納米粒子摻雜的DNA-CTMA-DPFP材料的薄膜樣品，通過實(shí)驗(yàn)測量和分析，對各種薄膜樣品的吸收和熒光光學(xué)特性及不同金納米粒子摻雜質(zhì)量比的薄膜樣品的拉曼特性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，在785 nm激光激發(fā)下，薄膜樣品的拉曼散射主要來自DPFP分子，而且由于金納米粒子對樣品中DPFP分子具有SERS效應(yīng)，隨著薄膜樣品中金納米粒子摻雜比的增加，激發(fā)的DPFP分子的拉曼光譜強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)。因此，在制備生物光學(xué)傳感器件方面，具有較大金納米粒子摻雜比的DNA-CTMA薄膜適合作為多種染料分子表面增強(qiáng)拉曼散射的基底。

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