偶聯(lián)鈉離子轉(zhuǎn)運草酰乙酸脫羧酶研究進展

姜巨全，黃海鵬，孟 婧，胡寶忠

（東北農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，大豆生物學教育部重點實驗室，哈爾濱 150030）

細菌在細胞質(zhì)膜上進行能量轉(zhuǎn)化過程中，質(zhì)子是主要偶聯(lián)離子[1-2]。許多初級鈉離子泵借助膜內(nèi)外鈉離子梯度行使功能同時偶聯(lián)質(zhì)子轉(zhuǎn)運[3]。次級鈉氫逆向轉(zhuǎn)運蛋白則會以跨膜質(zhì)子電化學梯度為驅(qū)動力確立鈉離子濃度梯度[4]。偶聯(lián)鈉離子轉(zhuǎn)運脫羧酶作為一個酶家族，在細菌質(zhì)膜上催化脫羧反應進行能量轉(zhuǎn)化同時，偶聯(lián)鈉離子、質(zhì)子跨膜運輸，屬于初級鈉離子泵。該酶家族主要包括：草酰乙酸脫羧酶（Oxaloacetate decarboxylase）[5-6]、甲基丙二酰輔酶A脫羧酶（Methylmalonyl-CoA decar?boxylase）[7]、戊烯二酰輔酶A脫羧酶（Glutaconyl-CoA decarboxylase）[8]、丙二酸鹽脫羧酶（Malonate decarboxylase）[9]。其中草酰乙酸脫羧酶是該羧酶家族中第一個被發(fā)現(xiàn)具有初級鈉離子泵活性脫羧酶[10]。

草酰乙酸脫羧酶分為細胞質(zhì)型和質(zhì)膜型兩種。前者不具有偶聯(lián)鈉離子轉(zhuǎn)運功能，首先在溶壁微球菌（Microcococcus lysodeikticus）中被發(fā)現(xiàn)[11]，并在乳球菌屬（Lactococcus）[12-13]、假單胞菌屬（Pseudomonas）[14]及棒狀桿菌屬（Corynebacterium）[15-16]等多個細菌屬中相繼被鑒定。后者具有偶聯(lián)鈉離子轉(zhuǎn)運功能，最早在產(chǎn)氣克萊勃氏桿菌（Klebsiella aerogenes）中被發(fā)現(xiàn)，其生理學基本特征被初步鑒定[10]，繼而在其他腸道致病細菌如霍亂弧菌（Vibrio cholerae）[17]、鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）[18]等中被發(fā)現(xiàn)和鑒定。本實驗室在松嫩平原鹽堿地中分離得到一株中度嗜鹽鹽單胞菌新種并將其命名Halomonas songnenensis，利用基因功能互補與基因文庫技術(shù)相結(jié)合方法，從該菌基因組上克隆得到一個編碼偶聯(lián)鈉離子轉(zhuǎn)運草酰乙酸脫羧酶基因簇oadGAB，目前正在對該酶活性以及鈉離子轉(zhuǎn)運機制進行鑒定。目前為止，肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）中草酰乙酸脫羧酶偶聯(lián)鈉離子轉(zhuǎn)運脫羧反應機制已被詳細地進行分析。本文綜述具有偶聯(lián)鈉離子轉(zhuǎn)運草酰乙酸脫羧酶生理學基本特征及其亞基結(jié)構(gòu)，以及拓撲異構(gòu)學、氨基酸定點突變等方法所獲得該酶鈉離子轉(zhuǎn)運脫羧反應機制研究進展。

1 草酰乙酸脫羧酶在檸檬酸發(fā)酵途徑中關(guān)鍵作用

1.1 檸檬酸發(fā)酵途徑

檸檬酸通過偶聯(lián)鈉離子輸出被攝入菌體，在檸檬酸裂解酶催化作用下分解為草酰乙酸和醋酸[19]。草酰乙酸被質(zhì)膜上草酰乙酸脫羧酶脫羧，生成丙酮酸，同時脫羧反應偶聯(lián)兩個鈉離子排出到細胞外。丙酮酸被進一步分解為乙酰輔酶A和甲酸，緊接著乙酰輔酶A反應形成乙酰磷酸。乙酰磷酸最后生成醋酸，反應過程中催化ADP生成ATP。在這個反應途徑中，用于生物合成反應NADH合成尤為重要。肺炎克雷伯菌生長在高氧化檸檬酸基質(zhì)中時必須為生物合成反應合成NADH，而這在檸檬酸循環(huán)中是不可行，因為α酮戊二酸脫氫酶合成會被缺氧抑制，但它具有獨特的NADH生物合成途徑：甲酸氫裂解酶產(chǎn)生氫氣，然后經(jīng)一個膜上氫化酶催化氫氣和NAD+，生成NADH[20]。在檸檬酸發(fā)酵途徑中，每消耗1 mol檸檬酸，生成一個1 mol ATP，同時行成一個鈉離子電化學梯度。之后，這種電化學梯度被電中性檸檬酸鈉：氫同向轉(zhuǎn)運蛋白利用，驅(qū)動向胞內(nèi)運送檸檬酸。

1.2 基因組成

檸檬酸發(fā)酵途徑所必需基因在肺炎克雷伯菌基因組上共同組成一個基因簇[21-22]，正向組成包括編碼檸檬酸鈉：氫同向轉(zhuǎn)運蛋白citS基因，以及跟隨在其后面由編碼草酰乙酸脫羧酶oadGAB基因和編碼一個雙組份調(diào)控系統(tǒng)citA/B基因。反方向組成包括編碼檸檬酸裂解酶連接酶citC基因和編碼檸檬酸裂合酶三個亞基citDEF基因以及編碼一個參與檸檬酸裂合酶生物素合成酶citG基因[23]。有研究指出肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）中有關(guān)檸檬酸發(fā)酵途徑基因在不同菌株中呈現(xiàn)出遺傳基因多樣性，而該多樣性與不同生長環(huán)境存在營養(yǎng)物質(zhì)多樣性關(guān)系很大[24]。

2 草酰乙酸脫羧酶亞基

2.1 亞基組成

草酰乙酸脫羧酶由三個不同亞基α、β、λ以1∶1∶1 比例組成[25-26]。如圖 1 所示，外圍α亞基（63.5 ku）包含兩個不同結(jié)構(gòu)域，即N端羧基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域和C端生物素結(jié)合結(jié)構(gòu)域[5]。一個富含脯氨酸和丙氨酸肽鏈連接著生物素在這兩個結(jié)構(gòu)域間置換。肽鏈上距C端35個氨基酸殘基處，生物素以共價鍵連接在一個賴氨酸殘基上。草酰乙酸脫羧酶β亞基（44.9 ku）呈強疏水性，緊密結(jié)合在質(zhì)膜上[6]。γ亞基（8.9 ku）由兩個結(jié)構(gòu)域組成，N端錨定在質(zhì)膜上，由一個脯氨酸和丙氨酸鏈與親水C端結(jié)構(gòu)域相連接[27]。C端包含有一個多組氨酸結(jié)構(gòu)，為綁定在C端二價鋅離子提供配體[28-29]。由于γ亞基不僅與水溶性α亞基蛋白相互作用，同時也與質(zhì)膜上β亞基蛋白相互協(xié)調(diào)，γ亞基對草酰乙酸脫羧酶多亞基復合體穩(wěn)定性具有重要作用[29]。

草酰乙酸脫羧酶可以被分離純化，提取方法大體分兩步，先利用去垢劑從膜上溶解下草酰乙酸脫羧酶蛋白，然后通過相應抗生素蛋白瓊脂糖柱進行親和色譜層析[25]。肺炎克雷伯菌草酰乙酸脫羧酶三亞基復合體，通過誘導表達已在大腸桿菌中被成功合成，為利用突變方法對其進行研究提供便利，并且雙亞基復合體αγ和βγ也已在試驗中得到克隆、表達和分離[29]。

圖1 草酰乙酸脫羧酶全景幾何構(gòu)型及其酶促反應特征Fig.1 Overall geometry of the oxaloacetate decarboxylase and features of the catalytic reactions

2.2 亞基作用

草酰乙酸脫羧酶催化反應循環(huán)始于草酰乙酸被結(jié)合到α亞基羧基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域上[25]，隨后，草酰乙酸羧基被轉(zhuǎn)移到生物素上，經(jīng)過富有韌性脯氨酸丙氨酸鏈置換作用，羧化生物素從α亞基上羧基轉(zhuǎn)移酶位點移動到β亞基上脫羧酶位點[30]。在羧基生物素脫羧過程中，一個由膜外導入質(zhì)子被消耗，同時兩個鈉離子被泵入周質(zhì)空間[31]。這一系列生物化學反應與其蛋白構(gòu)象變化緊密相關(guān)。例如，在兩個起催化作用結(jié)構(gòu)域間置換生物素組分可能負責開啟和關(guān)閉鈉離子通道，這些構(gòu)象變化在空間和時間上與生化反應協(xié)調(diào)一致，對整個脫羧反應具有至關(guān)重要作用。

3 Zn2+在羧基轉(zhuǎn)移酶催化反應中作用

草酰乙酸脫羧酶中，每1 mol脫羧酶都含有1 mol緊密結(jié)合在γ亞基上Zn2+[32]。Zn2+在羧基轉(zhuǎn)移酶催化反應時起到重要作用[33]。它協(xié)調(diào)作用于草酰乙酸上碳、氧原子，使氧原子因吸引與其相鄰碳原子所共用電子而帶負電，從而促進草酰乙酸上C-C基斷裂，分解生成丙酮酸和羧化生物素[32]。將草酰乙酸脫羧酶α亞基置于含14C標記草酰乙酸環(huán)境中，嘗試通過檢測含14C標記羧基生物素蛋白量監(jiān)控羧基轉(zhuǎn)運反應。但是，羧基轉(zhuǎn)運反應速率過低，以致于無法準確地監(jiān)測羧基轉(zhuǎn)移酶生理學活性。當加入γ亞基后，羧基轉(zhuǎn)運反應速率大大提高，羧基轉(zhuǎn)移酶活性可被監(jiān)測到[29]。在γ亞基D62A和H77A突變株中，脫羧酶中Zn2+含量降到野生型35%和10%，當突變刪除γ亞基C末端殘基H82和P83時，酶中Zn2+含量降低5%。當相對應Zn2+含量減少時，這些突變株中草酰乙酸脫羧酶活性喪失[34]。在霍亂弧菌中，當突變猜測Zn2+離子配體γ亞基A17、H207、H209時，脫羧酶完全喪失活性[35]。這些結(jié)果一致說明γ亞基同它Zn2+在羧基轉(zhuǎn)運催化機制中起著重要作用。

4 膜上β亞基拓撲異構(gòu)學分析

膜蛋白拓撲學分析是描述一個跨膜蛋白跨膜片段數(shù)量、方向以及C端與N端分布。草酰乙酸脫羧酶β亞基是由433個氨基酸殘基組成疏水性蛋白，疏水性分析顯示，它具有9至10個跨膜結(jié)構(gòu)。在推測跨膜區(qū)中，選擇多個位點打斷目蛋白肽鏈，使之與堿性磷酸酶或β-半乳糖苷酶形成融合蛋白，通過檢測融合點位置分析整個蛋白跨膜情況。

4.1 β亞基上主要螺旋蛋白及組成

β亞基拓撲模型顯示，它具有一個N末端在膜內(nèi)細胞質(zhì)一側(cè)，一個C末端在膜外周質(zhì)一側(cè)，整個蛋白折疊在一起鑲嵌在膜上，存在三個跨膜N末端螺旋，并由一個較大胞質(zhì)環(huán)連通著螺旋Ⅱ和螺旋Ⅲ。進一步拓撲學分析表明，β亞基C末端部分由6個螺旋折疊形成，它N末端和C末端之間蛋白部分呈現(xiàn)出一個不規(guī)則折疊，為Ⅲa區(qū)域[36]。

4.2 β亞基上具有重要作用Ⅲa跨膜域

氨基酸殘基179～189之間肽段構(gòu)成一個環(huán)（見圖2），該肽段氨基酸殘基并不是完全保守，因為其中部分氨基酸殘基在相關(guān)脫羧酶家族成員中并不存在。拓撲學分析表明，這一肽段應該定位在膜周質(zhì)空間，這就排除Ⅲa區(qū)域會折疊成兩個跨膜螺旋可能。有研究暗示，Ⅲa肽段是從靠近周質(zhì)空間膜表面嵌入質(zhì)膜中，但并沒有完全穿透膜至靠近細胞質(zhì)一側(cè)膜表面（見圖2）[36]。Ⅲa跨膜域極特殊重要性，不僅在于其C端在膜上特殊折疊方式，更是因為其包含一個重要氨基酸殘基D203，該殘基定位于草酰乙酸脫羧酶β亞基中由7個連貫非變異氨基酸殘基構(gòu)成最保守區(qū)域內(nèi)（見圖2）[30]。

圖2 草酰乙酸脫羧酶β亞基內(nèi)特定位點氨基酸突變Fig.2 Location of the amino acids within the β subunit of oxaloacetate decarboxylas which have been changed by site-directed mutagenesis

5 基于定點突變β亞基功能研究

為鑒定草酰乙酸脫羧酶β亞基上重要氨基酸殘基功能，可以使用氨基酸定點突變方法，通過研究突變株特性來分析突變意義。β亞基肽鏈上保守氨基酸殘基被認為在功能上具有重要作用，尤其是鑲?cè)肽ど息骯區(qū)域極性氨基酸殘基，它們可能是鈉離子和氫離子跨膜運輸最主要參與者。

5.1 β亞基上主要突變位點及鈉離子泵活性鑒定

圖2簡要標注β亞基（OadB）上所有被突變過氨基酸殘基[10,16,22]。其中，氨基酸殘基D203、Y229、G377、S382中任何一個突變都導致草酰乙酸脫羧酶活性完全喪失，N373、R389突變大幅度地降低脫羧活性，而在其他位點如T148、G200、Y227、G380等突變并未明顯影響草酰乙酸脫羧酶活性。D203（Ⅲa區(qū)域）[10]、Y229（螺旋Ⅳ）[22]、和G377或S382（螺旋Ⅷ）[16]等突變可使草酰乙酸脫羧酶活性降低，甚至完全喪失。

5.2 D203對β亞基功能作用

首個被鑒定出對于酶活性不可缺少功能性氨基酸殘基是Ⅲa區(qū)域D203，即將203處保守天冬氨酸轉(zhuǎn)為E、N、Q，均導致草酰乙酸脫羧酶完全喪失活性，并且突變后酶同時喪失初級鈉離子泵活性[23]。鈉離子泵活性是通過與大腸桿菌EP432（被敲出鈉氫逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因大腸桿菌突變株菌株，不能在含鹽350 mmol·L-1pH6葡萄糖礦物鹽培養(yǎng)基上生長）功能互補試驗來檢測。野生型草酰乙酸脫羧酶基因轉(zhuǎn)化EP432后，因具有初級鈉離子泵活性可恢復其在高鹽環(huán)境中生長能力[16]。然而，D203突變株草酰乙酸脫羧酶缺失初級鈉離子泵活性，故不能與EP432進行功能互補恢復其在高鈉離子濃度下生長。

草酰乙酸脫羧酶α亞基催化羧基轉(zhuǎn)移酶活性，不會被β亞基D203突變所影響[13]，這個酶可快速地催化14CO2從（4-14C）草酰乙酸上轉(zhuǎn)移到共價生物素組分上[10]。因D203突變徹底敲出羧基生物素脫羧活性，生成含14C標記羧基生物素即使在鈉離子環(huán)境中也很穩(wěn)定。而在野生型酶中，羧基生物素酶會被立即脫羧而不能形成一個穩(wěn)定中間產(chǎn)物。因此，D203對羧基生物素脫羧反應必不可少，而鈉離子轉(zhuǎn)運是與此偶聯(lián)。D203可能提供一個雙重作用，為轉(zhuǎn)運溶解鈉離子而提供結(jié)合位點和作為質(zhì)子運送載體，引導質(zhì)子反方向運動到達催化反應位點以備羧基生物素脫羧反應[10]。

5.3 S382對β亞基功能作用

羧基生物素脫羧反應及鈉離子泵也同樣依靠螺旋Ⅷ上S382。當這個氨基酸殘基被突變?yōu)锳、C、E、N或Q，即使在保留羧基轉(zhuǎn)運活性情況下，草酰乙酸脫羧酶和鈉泵活性也會完全消除[16]。而當將S382突變?yōu)楸Ｊ豑時，草酰乙酸脫羧酶會保持脫羧活性和鈉離子泵活性，在S382突變?yōu)镈時，這些活性會降低。突變株表現(xiàn)出酶活力對于研究S382在鈉泵及羧基生物素脫羧中作用有重要指導意義。

所有在位點382可接納氨基酸殘基都攜帶一個羥基組分或一個酸性位點（S、T或D），這個結(jié)構(gòu)可以使其轉(zhuǎn)運質(zhì)子到催化反應位點，從而啟動羧基生物素脫羧反應[16]。位點382也可能是鈉離子結(jié)合位點，因為當S382→E時，延長同方向氨基酸殘基側(cè)鏈，可能會通過擾亂這一范圍中無機鹽離子可溶性協(xié)調(diào)，使得鈉離子不能結(jié)合，從而導致此突變株喪失活性。所以，S382可能具有雙重作用：當可溶性鹽離子被由胞質(zhì)運入膜時，作為離子結(jié)合位點；而當質(zhì)子被引導反方向運送由周質(zhì)至膜上催化位點時，作為氫結(jié)合位點。所以，S382同D203具有相似功能，而且這兩個氨基酸殘基都可能是膜上鈉氫轉(zhuǎn)運網(wǎng)絡(luò)重要部分。為起到質(zhì)子傳導功能，S382富含羥基側(cè)鏈必須要在質(zhì)子化和去質(zhì)子化間轉(zhuǎn)變。在水環(huán)境中，絲氨酸羧基組分PK＞13,因此在生理學條件下不會發(fā)生去質(zhì)子化[16]。然而，就如同絲氨酸蛋白酶對絲氨酸作用一樣，去質(zhì)子化可以在酶中疏水空間內(nèi)，通過組氨酸和天冬氨酸成對作用來完成。

5.4 β亞基上R389功能推測

負責從β亞基上S382接收質(zhì)子，可能是羧基生物素配體R389。R389氨基酸殘基處在兩個螺旋上，繞開S382朝向膜胞質(zhì)一側(cè)，這兩個氨基酸殘基都將它們側(cè)鏈暴露在同一方向。R389非常保守，S382和R389在傳導質(zhì)子路徑方面，有密切作用相互關(guān)系[17]。R389→K突變株表現(xiàn)出與野生型幾乎相同草酰乙酸脫羧酶活性，同時也具有鈉泵活性。在pH 9時，R389→C活性會降低，而當降低到野生型最適pH 6.5時，酶活性得以恢復[25]。當pH值由最適pH值提高兩個單位時，對比R389→A、R389→L突變株與野生型酶活性，推測質(zhì)子可能由S382經(jīng)過R389傳遞給羧基生物素，從此處開啟這個酸性復合物脫羧反應[16]。

5.5 β亞基上保守Y227和Y229重要性

β亞基上有兩個保守酪氨酸殘基，是在螺旋Ⅳ上Y227和Y229。如果將酪氨酸227突變成丙氨酸，則草酰乙酸脫羧酶活性從45 U·mg-1（野生型）降到0.5 U·mg-1，而突變株Y227→C和Y227→F酶活力更高一些，其酶活力分別降到12和9 U·mg-1[22]。因此，Y227對于保證酶高效催化作用是十分重要。而酪氨酸229對于酶重要性表現(xiàn)在，即使用苯基丙氨酸對酪氨酸做很保守交換，都會完全使其失去草酰乙酸脫羧酶活性和鈉泵活性[37]。

6 能量偶聯(lián)分子模型

圖3為草酰乙酸脫羧酶能量偶聯(lián)機制工作模型[31,38]。在這個模型中，β亞基上標示兩個不同鈉離子結(jié)合位點，一個位于D203，另一個位于S382。在Ⅲa部分中，螺旋Ⅳ和螺旋Ⅷ排列成一個膜上疏水空間，為鈉離子和氫離子相互反向跨膜移動提供通道[39-40]。這個離子通道被預測擁有兩種不同構(gòu)象：構(gòu)象1是使鈉離子結(jié)合位點朝向細胞周質(zhì)，而構(gòu)象2則是當一階段催化反應完成后，鈉離子結(jié)合位點朝向胞質(zhì)。

6.1 伴隨構(gòu)象變化離子運輸途徑

在α亞基上，催化反應循環(huán)始于羧基轉(zhuǎn)移酶催化草酰乙酸提供羧基給生物素組分進行羧化反應。在圖3A中，羧基生物素被氨基酸殘基遞送到并結(jié)合在β亞基上脫羧酶催化位點?？缒ぢ菪希咏诎|(zhì)膜表面R389對堿性離子有較強吸引力，它不僅對羧基生物素與催化位點結(jié)合起到促進作用，同時還對此時構(gòu)象1起到穩(wěn)固作用。S382是質(zhì)子傳遞指揮網(wǎng)絡(luò)一部分，這個網(wǎng)絡(luò)還包含Y229、R389、H2O和羧基生物素[37]。當?shù)谝粋€鈉離子結(jié)合到Asp203上后，第二個鈉離子結(jié)合到S382，如圖3B所示。此時，R389同羧基生物素協(xié)同催化作用S382，降低S382pK值，如同絲氨酸蛋白酶上組氨酸和天冬氨酸共同催化絲氨酸一樣，使其更易去質(zhì)子化[37]。鈉離子由胞質(zhì)膜通道接近S382，在β亞基中形成疏水環(huán)境下，取代S382側(cè)鏈羥基上氫，重新形成離子對。這種取代會引起質(zhì)子傳遞網(wǎng)絡(luò)中氫重排，最后將一個質(zhì)子傳遞給羧基生物素來催化這個酸性不穩(wěn)定混合物立即脫羧。

如圖3C所示，這一系列質(zhì)子傳遞最終會引起整個蛋白模型構(gòu)象變化，模型轉(zhuǎn)化為構(gòu)象2，胞質(zhì)膜通道關(guān)閉，周質(zhì)膜通道打開。一個周質(zhì)膜外質(zhì)子由此通道進入，將最先結(jié)合在接近周質(zhì)膜表面D203上，使其釋放第一個鈉離子，隨后被傳送到S382，釋放第二個鈉離子，從而恢復S382羥基組分。D203和S382上鈉離子被釋放后，經(jīng)過通道，到達膜外周質(zhì)[40]。在所預測分子模型中，D203和S382是質(zhì)子轉(zhuǎn)移途徑中心和樞紐，這同樣與定點突變結(jié)果相一致，即二者之中任何一個氨基酸殘基突變，脫羧活性將完全喪失[30-31]。由圖3D→A所示，緊接著，α亞基上羧基轉(zhuǎn)移酶作用草酰乙酸加工生成羧基生物素將重新結(jié)合到β亞基上，模型恢復到穩(wěn)定構(gòu)象1，開始一個新反應循環(huán)。

圖3 羧基生物素脫羧基反應過程偶聯(lián)鈉氫離子跨膜運輸機制分子演示模式圖Fig.3 Model for coupling Na+and H+movements across the membrane to the decarboxylation of carboxybiotin

6.2 草酰乙酸脫羧酶能量偶聯(lián)分子機制特點

在草酰乙酸脫羧酶鈉離子轉(zhuǎn)運反應循環(huán)中，有兩個鈉離子被由胞質(zhì)運送至細胞周質(zhì)，一個來自細胞周質(zhì)質(zhì)子在羧基生物素脫羧時被利用[41]。氨基酸殘基N373可以看作是D203配體，兩個殘基都位于周質(zhì)膜表面附近，它可能會協(xié)調(diào)促進D203對鈉離子結(jié)合，N373→L、N373→D突變株都只保留很弱草酰乙酸脫羧酶活性。將R389突變?yōu)橹行园被酇或L后，可以檢測到酶活性降低，但不會完全喪失，即使R389→D突變株也會保留一部分活性[31]。

這個離子轉(zhuǎn)運機制與所驗證一個分子草酰乙酸對應兩分子鈉離子外排[42]，同時會有一個分子質(zhì)子運至膜內(nèi)是一致[30]。這個模型更揭示催化過程中化學和數(shù)量上對應關(guān)系，同時說明生物素羧化和脫羧反應是鈉離子跨膜轉(zhuǎn)運所必需。草酰乙酸脫羧反應對鈉離子的依賴性在此也得到證實，因為S382上質(zhì)子需要提供給脫羧反應，而只有侵入鈉離子能替換下這個質(zhì)子[41]。運用此模型也可以對草酰乙酸脫羧酶活性會被高鈉濃度和高pH值抑制作出解釋，因為在此條件下，很難從低親和力位點（膜上鈉離子親和位點）轉(zhuǎn)換到鈉離子，整個反應過程會變得遲緩[30]。

7 問題與展望

草酰乙酸脫羧酶鈉泵偶聯(lián)機制主要特點是利用嵌入膜氨基酸殘基S382、D203-N373作為結(jié)合位點，及與其作用密切相關(guān)氨基酸殘基共同形成鈉離子、質(zhì)子傳遞網(wǎng)絡(luò)，引導鈉離子和氫相對方向定向運動。由賴氨酸殘基連接生物素將草酰乙酸脫羧及羧基生物素脫羧這兩部分反應在生化反應能量傳遞上，及空間轉(zhuǎn)移上有機地結(jié)合在一起。能量偶聯(lián)分子模型被用以描述這一直接偶聯(lián)機制。在草酰乙酸脫羧酶β亞基中，鈉離子結(jié)合觸發(fā)質(zhì)子反向跨膜運動到達催化位點，在這里它們被消耗在催化反應中。

利用基因定點敲除技術(shù)，對突變處為D203、S382、Y229突變株研究從側(cè)面驗證反應機制模型，證明這些殘基組成質(zhì)子轉(zhuǎn)運通道對催化作用至關(guān)重要。隨著研究深入，在分子結(jié)構(gòu)層面，對于某些氨基酸殘基作用，存在許多新問題。如S382可以被D取代，但卻不能被N、E或Q取代，由于其必須為鈉離子提供結(jié)合位點，所以是否是在其鏈延伸方向上，氨基酸殘基側(cè)鏈長度起到至關(guān)重要作用；G377也是β亞基上一個關(guān)鍵殘基，它的突變株完全失去脫羧酶活性，但目前對其研究較少，只是認為其在結(jié)構(gòu)上起重要作用。在生化反應層面，以分子結(jié)構(gòu)研究為基礎(chǔ)，使通過對基因序列改變來正向調(diào)節(jié)脫羧酶活性及對鈉離子運輸能力成為可能。草酰乙酸脫羧酶作為重要初級鈉離子泵之一，隨著對其偶聯(lián)鈉離子轉(zhuǎn)運脫羧機制研究不斷深入，將為對其他鈉離子初級泵及次級泵研究提供更廣闊視野。同時，利用草酰乙酸脫羧酶鈉離子轉(zhuǎn)運特性，對其異源表達以改造菌體耐鹽能力，將在構(gòu)造耐鹽工程菌株中產(chǎn)生重要作用。

[1] Mulkidjanian AY,Dibrov P,Galperin MY.The past and present of sodium energetics:May the sodium-motive force be with you[J].Biochim Bioph Acta,2008,177:985-992.

[2] Li T,Huo L,Pulley C,Liu A.Decarboxylation mechanisms in bio?logical system[J].Bioorg Chem,2012,43:2-14.

[3] Batista A P,Marreiros B C,Pereira M M.The role of proton and sodium ions in energy transduction by respiratory complex I[J].IUBMB Life,2012,64:492-498.

[4] Padan E,Schuldiner S.Na+/H+antiporters,molecular devices that couple the Na+and H+circulation in cells[J].J Bioenerg Biomem,1993,25:647-669.

[5] Schwarz E,Oesterhelt D,Reinke D,et al.The sodium ion translo?cating oxalacetate decarboxylase of Klebsiella pneumoniae.Se?quence of the biotin-containing alpha-subunit and relationship to other biotin-containing enzymes[J].J Bio Chem,1988,263:9640-9645.

[6] Woehlke G,Wifling K,Dimroth P.Sequence of the sodium ion pump oxaloacetate decarboxylase fromSalmonella typhimurium[J].J Bio Chem,1992,267:22798-22803.

[7] Grove T L,Benner J S,Radle M I,etal.A Radically different mechanism forS-adenosylmethionine-dependent methyltransfer?ases[J].Science Magazine,2011,332:604-607.

[8] Braune A,Bendrat K,Rospert S,et al.The sodiumion translocat?ing glutaconyl-CoA decarboxylase from Acidaminococcusfermen?tans:cloning and function of the genes forming a second operon[J].Mol Microbiol,1999,31:473-487.

[9] Berg M,Hilbi H,Dimroth P.Sequence of a Gene Cluster from Malonomonas Rubra encoding components of the malonate decar?boxylase Na+pump and evidence for their function[J].Eur J Bio?chem,1997,245:103-115.

[10] Dimroth P.A new sodium-transport system energized by the de?carboxylation of oxaloacetate[J].FEBS Lett,1980,122:234-236.

[11] Krampitz LO,Werkman CH.The enzymic decarboxylation of oxa?loacetate[J].J Bio Chem,1941,35:595-602.

[12] Sender PD,Mart?ín MG,Peirú S,et al.Characterization of an oxa?loacetate decarboxylase that belongs to the malic enzyme family[J].FEBS Lett,2004,570:217-222.

[13] Augagneur Y,Garmyn D,Guzzo J.Mutation of the oxaloacetate decarboxylase gene of Lactococcus lactis subsp.lactis impairs the growth during citrate metabolism[J].J Appl Microbiol,2008,104:260-268.

[14] Narayanan BC,Niu WL,Han Y,et al.Structure and function of PA4872 from Pseudomonas aeruginosa,a novel class of oxaloace?tate decarboxylase from the PEP mutase/isocitrate lyase superfam?ily[J].Biochemistry,2008,47:167-182.

[15] Ran T,Wang Y,Xu D,Wang W.Expression,purification,crystal?lization and preliminary crystallographic analysis of Cg1458:a novel oxaloacetate decarboxylase from Corynebacterium glutami?cum[J].Acta Cryst,2011,67:968-970.

[16] Klaff l S,Eikmanns B J.Genetic and functional analysis of the sol?uble oxaloacetate decarboxylase fromCorynebacterium glutami?cum[J].J Bacteriol,2010,192:2604-2612.

[17] Dahinden P,Pos K,Dimroth P.Identif i cation of a domain in the a-subunit of the oxaloacetate decarboxylase Na+pump that accom?plishes complex formation with the γ-subunit[J].FEBS J,2007,272:846-855.

[18] Wifling K,Dimroth P.Isolation and characterization of oxaloace?tate decarboxylase ofSalmonella typhimurium,a sodium ion pump[J].Arch Microbiol,1989,152:584-588.

[19] Saladino R,Brucato J R,Sio A D,et al.Photochemical synthesis of citric acid cycle intermediates based on titanium dioxide[J].As?trobiology,2011,11:815-824.

[20] Steuber J,Krebs W,Bott M,et al.A Membrane-Bound NAD（P）+-Reducing hydrogenase provides reduced pyridine nucleo?tides during citrate fermentation by Klebsiella pneumoniae[J].J Bacteriol,1999,181:241-245.

[21] Bott M,Dimroth P.Klebsiella pneumoniae genes for citrate lyase and citrate lyase ligase:localization,sequencing,and expression[J].Mol Microbiol,1994,14:347-356.

[22] Bott M,Meyer M,Dimroth P.Regulation of anaerobic citrate me?tabolism in Klebsiella pneumoniae[J].Mol Microbiol,1995,18:533-546.

[23] Schneider K,Dimroth P,Bott M.Biosynthesis of the prosthetic group of citrate lyase[J].Biochemistry,2000,39:9438-9450.

[24] Chen Y T,Liao T L,Wu K M.Genomic diversity of citrate fermen?tation in Klebsiella pneumoniae[J],BMC Microbiol,2009(9):1471-2180.

[25] Dimroth P,Thomer A.Subunit composition of oxaloacetate decar?boxylase and characterization of the a chain as carboxyltransferase[J].Eur J Biochem,1983,137:107-112.

[26] Dimroth P,Thomer A.Dissociation of the sodium-ion-translocat?ing oxaloacetate decarboxylase of Klebsiella pneumoniae and re?constitution of the active complex from the isolated subunits[J].Eur J Biochem,1988,175:175-180.

[27] Dahinden P,Pos K M,Dimroth P.Identification of a domain in the α-subunit of the oxaloacetate decarboxylase Na+pump that accomplishes complex formation with the β-subunit[J].FEBS J,2005,272:846-855.

[28] Dimroth P,Thomer A.The sodium ion pumping oxaloacetate de?carboxylase of Klebsiella pneumoniae Metal ion content[J].FEBS Lett,1992,300(1):67-70.

[29] Berardino M D,Dimroth P.Synthesis of the Oxaloacetate decar?boxylase Na+pump and its individual subunits in Escherichia Coli and analysis of their function[J].Eur J Biochem,1995,231:790-801.

[30] Berardino M D,Dimroth P.Aspartate 203 of the oxaloacetate de?carboxylase beta-subunit catalyses both the chemical and vectori?al reaction of the Na+pump[J].Embo J,1996,15:1842-1849.

[31] Jockel P,Schmid M,Steuber J,Dimroth P.A Molecular coupling mechanism for the oxaloacetate decarboxylase Na+pump as in?ferred from mutational analysis[J].Biochemistry,2000,39:2307-2315.

[32] Espariz M,Repizo G,Blancato V,et al.Identif i cation of malic and soluble oxaloacetate decarboxylase enzymes in Enterococcus faecalis[J].FEBS J,2011,278:2140-2151.

[33] Hall P R,Zheng R,Antony L,et al.Transcarboxylase 5S struc?tures:assembly and catalytic mechanism of amultienzyme com?plex subunit[J].EMBO J,2004,23:3621-3631.

[34] Schmid M,Wild M R,Dahinden P,et al.Subunit γ of the oxaloac?etate decarboxylase Na+pump:interaction with other subunits/do?mains of the complex and binding site for the Zn2+metalion[J].Biochemistry,2002,41:1285-1292.

[35] Studer R,Dahinden P,Wang W W,et al.Crystal Structure of the Carboxyltransferase domain of the oxaloacetate decarboxylase Na+Pump from Vibrio cholerae[J].J Mol Biol,2007,367(2):547-557.

[36] Jockel P,Berardino M D,Dimroth P.Membrane topology of the β-subunit of the oxaloacetate decarboxylase Na+pump from Kleb?siella pneumoniae[J].Biochemistry,1999,38:13461-13472.

[37] Jockel P,Schmid M,Choinowski T,et al.Essential role of tyro?sine 229 of the oxaloacetate decarboxylase β-subunit in the ener?gy coupling mechanism of the Na+pump[J].Biochemistry,2000,39:4320-4326.

[38] Pinner E,Kolter Y,Padan E,et al.Physiological role of NhaB,a specific Na+/H+antiporter in Escherichia coli[J].J Biol Chem,1993,268:1729-1734.

[39] Wild MR,Pos K M,Dimroth P.Site-directed sulfhydryl labeling of the oxaloacetate decarboxylase Na+pump ofKlebsiella pneu?moniae:helix VIII comprises a portion of the sodium ion channel[J].Biochemistry,2003,42:11615-11624.

[40] Schmid M,Vorburger T,Pos K M,et al.Role of conserved resi?dues within helicesⅣ and Ⅷ of the oxaloacetate decarboxylase β subunit in the energy coupling mechanism of the Na+pump[J].Eur J Biochem,2002,269:2997-3004.

[41] Saylor B T,Reinhardt L A,Lu Z,et al.A structural element that facilitates proton-coupled electron transfer in oxalate decarboxyl?ase[J].Biochemistry,2012,51:2911-2920.

[42] Dimroth P,Thomer A.On the mechanism of sodium ion transloca?tion by oxaloacetate decarboxylase of Klebsiella pneumoniae[J].Biochemistry,1993,32:1734-1739.