部分薔薇屬種質(zhì)資源的白粉病抗性評(píng)價(jià)1)

王蘊(yùn)紅 王金耀 張啟翔 羅 樂 于 超 潘會(huì)堂

(北京林業(yè)大學(xué)，北京，100083)

月季(Rosa spp.)是世界性的重要觀賞植物之一。月季白粉病(Podosphaera pannosa)是世界性病害，在月季栽培區(qū)均有發(fā)生，同時(shí)也是溫室栽培月季類的最主要真菌病害［1－2］。病情嚴(yán)重時(shí)會(huì)引起早落葉、枯梢、花蕾畸形或完全不能開放，降低切花產(chǎn)量和觀賞性，連年發(fā)生則嚴(yán)重削弱植株的長(zhǎng)勢(shì)［3］。培育對(duì)白粉病抗性強(qiáng)的月季品種，一直是月季育種的一項(xiàng)重要挑戰(zhàn)，但成功者寥寥無幾。主要原因在于現(xiàn)代月季品種的基因庫(kù)中缺乏白粉病高抗性的基因，對(duì)抗性機(jī)制的了解有限，白粉病病原菌生理小種具有高度多樣性和變異性［2］，以及缺少篩選抗病性材料的可靠方法［4］。近幾十年來，研究者評(píng)價(jià)了許多薔薇屬資源的白粉病抗性，尤其是月季栽培品種，但是免疫的品種卻寥寥無幾［4－8］。并且由于白粉病病原菌生理小種多樣性，容易發(fā)生變異，原來許多高抗病的資源已經(jīng)失去了其優(yōu)良的抗性特質(zhì)，如‘明星’(‘Super Star’)月季［9］。

現(xiàn)代月季品種盡管非常豐富，觀賞價(jià)值高，但在抗病性等方面仍有不足，急需引入更優(yōu)良的薔薇遺傳資源［10］。而眾多的野生薔薇屬優(yōu)良種質(zhì)資源尚未被開發(fā)利用，基礎(chǔ)研究匱乏。因此，了解以及評(píng)價(jià)野生薔薇資源對(duì)白粉病的抗性，篩選具有較高抗性甚至免疫的薔薇屬植物種質(zhì)資源，對(duì)培育具有較高抗性的月季新品種具有重要意義。陳俊愉院士曾對(duì)新疆的野生薔薇資源予以高度評(píng)價(jià)，認(rèn)為在新疆原產(chǎn)的野生薔薇中，一些高度抗寒、抗旱、抗病的種類是最有希望和最有價(jià)值的月季育種材料［11］。在此背景下，本試驗(yàn)在觀察白粉病病原菌侵染過程的基礎(chǔ)上，對(duì)5種10份新疆野生薔薇種質(zhì)資源和4個(gè)月季栽培品種進(jìn)行了白粉病抗性評(píng)價(jià)，旨在篩選出具有優(yōu)良抗病基因的新疆野生薔薇屬種質(zhì)，用于月季新品種的培育工作。

1 材料與方法

供試材料為從新疆不同地域收集的薔薇屬植物(表1)，包括4份彎刺薔薇(Rosa beggeriana)、3份疏花薔薇(R.laxa)、伊犁薔薇(R.iliensis)、喀什薔薇(R.laxa var.kaschgarica)、尖刺薔薇(R.oxyacantha)，以及‘紅衣主教’(‘Kardinal’)、‘黑魔術(shù)’(‘Black Magic’)、‘桔囊’(‘Ju Nang’)、‘太陽城’(‘Sun City’)4個(gè)月季品種。所有薔薇屬原種均以《中國(guó)植物志》［12］及《Flora of China》［13］為鑒定依據(jù)。

月季栽培品種的供試材料為1 a齡扦插苗，野生薔薇資源為1 a齡種苗，每盆栽植1株。在供試葉片生長(zhǎng)階段，不使用任何殺菌劑，生長(zhǎng)狀況良好，無任何病蟲害。所有供試材料的葉齡均為30～45 d，置于塑料棚內(nèi)進(jìn)行染菌處理。塑料棚內(nèi)日均溫度為21℃，平均相對(duì)濕度為78%。

表1 10份野生薔薇屬材料基本信息

月季白粉病菌源采自國(guó)家花卉工程技術(shù)研究中心(北京林業(yè)大學(xué))小湯山種質(zhì)資源圃內(nèi)，從染病的盆栽月季植株上收集新鮮的病原菌孢子。

接種方法:接種方法參照李卉的方法［14］，從染病的盆栽月季植株上收集新鮮的病原菌孢子，用自來水混合成孢子懸浮液，加入1～2滴吐溫20。使用血球計(jì)數(shù)板，調(diào)節(jié)孢子密度在104～105個(gè)·mL－1。迅速將孢子懸浮液均勻噴灑在供試植株葉片上，噴霧的劑量為60 mL·m－2。全部噴灑完畢后，再將噴有同等劑量清水的對(duì)照植株放入。試驗(yàn)采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，每品種處理12株。設(shè)置30株作為對(duì)照。

白粉病病原菌侵染過程觀察:參照Achuo et al.［15］的方法，以‘黑魔術(shù)’為觀察材料，在接種病原菌后的第24、48、72、96、120 h 分別采集5 枚葉片，固定液V(無水乙醇):V(冰醋酸)=3∶1，固定20 h后，流水沖洗4 h，之后置于保存液V(乳酸):V(甘油):V(水)=1∶1∶1內(nèi)，放入冰箱內(nèi)于4℃保存。觀察時(shí)制作成臨時(shí)裝片，用染色液(每10 mL蒸餾水中加入苯胺藍(lán)0.02 g，使用前以2倍體積的無水乙醇稀釋)染色。

白粉病抗性評(píng)價(jià):病情調(diào)查(分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)見表2)時(shí)間為從可以清晰觀察到病癥(接種后4d)起，直至易感病植株幾乎完全染病(接種后15d前后)為止(圖1)。

根據(jù)公式計(jì)算出群體發(fā)病的病情指數(shù)、相對(duì)病情指數(shù)及相對(duì)抗性指數(shù)［7－8，14］。

此兩例僅見于《齊》，《周》無，且都與“不”連用，構(gòu)成雙重否定，表強(qiáng)調(diào)，“靡”主要在先秦兩漢使用，此時(shí)期不太盛行。

病情指數(shù)=Σ(病級(jí)株數(shù)×病級(jí))/(株數(shù)總和×發(fā)病最重級(jí))×100%。

相對(duì)抗性指數(shù)=1－相對(duì)病情指數(shù)。

相對(duì)病情指數(shù)=品種病情指數(shù)/對(duì)照品種病情指數(shù)(病情指數(shù)最高者為對(duì)照品種)。

抗病程度分為免疫(I)、高抗(HR)、中抗(MR)、中感(MS)、高感(HS)5類，相對(duì)抗性指數(shù)分別為 1.00、0.80 ～0.99、0.40 ～0.79、0.20 ～0.39 和0.20 以下。

表2 月季白粉病病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

圖1 月季白粉病病情分級(jí)示意圖

病情發(fā)展過程分析:參照Yan的方法［4］，觀察并記錄從噴灑孢子懸浮液到初次有病癥可見的時(shí)間，即潛伏時(shí)間LP(latent period)。每24 h觀測(cè)1次，并計(jì)算病情級(jí)別的發(fā)展速率RSD(rate of symptom development)。病情級(jí)別的發(fā)展速率等于接種病原菌后第11 d的病情級(jí)別數(shù)與初次有病癥可見到侵染后第11 d的時(shí)間間隔的比率。

2 結(jié)果與分析

2.1 白粉病病原菌侵染過程觀察

從圖2中可看出，接種白粉病病原菌后，‘黑魔術(shù)’葉片上的白粉病菌菌絲數(shù)量隨著接種后的時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸增加。病原菌孢子在接種后24 h開始萌發(fā);48 h后長(zhǎng)出菌絲;72 h后形成的菌絲數(shù)量明顯增多，形成次生菌絲體;96 h后大量的菌絲形成，開始以絲狀連接在一起;接種120 h后，大量分生孢子梗出現(xiàn)，此時(shí)葉片上出現(xiàn)了肉眼可見的病斑。結(jié)果表明，白粉病病原菌侵染葉片的過程在接種后96～120 h即可完成。

2.2 白粉病抗性評(píng)價(jià)

圖2 病原菌在月季品種‘黑魔術(shù)’葉片表面的生長(zhǎng)過程

表3 供試材料的白粉病抗性表現(xiàn)

方差分析(表4)表明，各供試材料白粉病抗性在區(qū)組間的差異不明顯，而不同的供試材料表現(xiàn)出的白粉病抗性具有極顯著的差異。

表4 供試材料白粉病抗性方差分析

2.3 病情發(fā)展過程分析

侵染后的第11 d起，二次侵染愈加明顯。隨著侵染強(qiáng)度的增加，不同供試材料間抗性差別評(píng)價(jià)的準(zhǔn)確性有所降低。因此，選擇供試材料第11 d的病情級(jí)別作為分析比較依據(jù)［4］。

2.3.1 白粉病的潛伏時(shí)間

從表5可知，白粉病在供試材料上潛伏時(shí)間較多分布在5、6、8 d(各4份種質(zhì)材料)。潛伏期為7 d的材料只有2個(gè)，占供試材料總數(shù)的14.29%。月季栽培品種的白粉病病原菌潛伏期多數(shù)為5～6 d，而野生薔薇種質(zhì)的白粉病病原菌潛伏期多數(shù)為7～8 d。白粉病的潛伏時(shí)間越久，表明白粉病病原菌菌絲生長(zhǎng)緩慢。這表明，病原菌和寄主的識(shí)別以及抗病材料的抗病反應(yīng)會(huì)因材料的不同而有所差異。

2.3.2 供試材料的病級(jí)

從表5可知，接種病原菌后的第11 d，供試材料病級(jí)在0.01～0.50的分布最多(7個(gè))，其次為分布在2.01～2.50 的(3 個(gè))。其中，病情級(jí)別在0.01 ～0.50的材料占供試材料總數(shù)的50%。

病級(jí)越高，表明感染白粉病的程度越重，白粉病抗性越差。供試材料中，尖刺薔薇、疏花薔薇1號(hào)、彎刺薔薇2號(hào)的病情級(jí)別最低，分別為0.08、0.13和0.14;‘紅衣主教’、‘黑魔術(shù)’的病情級(jí)別較低，分別為0.30和0.44;‘桔囊’、‘太陽城’的病情級(jí)別較高，分別為2.00和2.08;伊犁薔薇、彎刺薔薇1號(hào)的病情級(jí)別最高，分別為2.23和2.37。

2.3.3 病級(jí)的發(fā)展速率

從表5可知，供試材料病級(jí)的發(fā)展速率最多分布在0～0.10(6個(gè))，其次分布在 0.30～0.40(4個(gè))。其中病級(jí)的發(fā)展速率在0～0.10的材料占供試材料總數(shù)的42.86%。病情發(fā)展速率越快，表明白粉病病原菌菌絲生長(zhǎng)的速度越快，材料的白粉病抗性也就越差。

供試材料中，病情級(jí)別發(fā)展速率最快的為彎刺薔薇1號(hào)(0.42)，最慢的為尖刺薔薇(0.02)，其余的發(fā)展速率由大到小的順序?yàn)?‘太陽城’(0.38)、伊犁薔薇(0.37)、彎刺薔薇 3號(hào)(0.35)、‘桔囊’(0.33)、疏花薔薇 3 號(hào)(0.08)、‘黑魔術(shù)’(0.07)、‘紅衣主教’(0.05)、彎刺薔薇 2 號(hào)(0.04)、疏花薔薇1 號(hào)(0.04)。

表5 供試材料的病情表現(xiàn)

3種病情指標(biāo)的方差分析(表6)表明，各供試材料在白粉病的潛伏時(shí)間、病級(jí)和病級(jí)的發(fā)展速率3方面的差異均達(dá)到極顯著水平。

表6 3種病情指標(biāo)的方差分析

3 結(jié)論與討論

白粉病病原菌侵染葉片的過程在接種后96～120 h即可完成。當(dāng)條件適宜時(shí)，病菌經(jīng)72 h即可完成其無性循環(huán)，在田間則需時(shí)7～10 d［17］。這種差異可能是由于試驗(yàn)環(huán)境溫濕度的差異造成的，也就意味著白粉病病原菌侵染過程極易受到外界環(huán)境條件的影響。不同供試材料的白粉病潛伏時(shí)間也有差異，原因可能是病原菌和寄主的識(shí)別以及材料的抗病反應(yīng)時(shí)間不同造成的，也導(dǎo)致了病情發(fā)展的速率不同。病情發(fā)展速率越快，代表著材料的抗病性越差，白粉病越容易擴(kuò)散、蔓延。因此，需要進(jìn)一步試驗(yàn)探明月季白粉病侵染過程中病原與植物互作的關(guān)鍵時(shí)期，這樣有助于探討植株對(duì)白粉病抗性存在差異的原因。

中國(guó)原產(chǎn)的薔薇屬植物有82種，約占全世界總數(shù)的41%，是野生薔薇的主要分布區(qū)之一。而新疆分布的薔薇屬資源在全國(guó)范圍內(nèi)僅次于云南、四川，位居第三［18］，在西北地區(qū)位居首位，是西北抗逆薔薇資源最豐富的地區(qū)之一［16］。然而，目前國(guó)內(nèi)尚未有人對(duì)分布于新疆的野生薔薇屬資源進(jìn)行白粉病的抗性評(píng)價(jià)。資源利用的盲目性會(huì)導(dǎo)致育種效率低，人力、物力的嚴(yán)重浪費(fèi)。因此，開展野生薔薇屬資源抗性評(píng)價(jià)，可以為培育具有抗白粉病的月季新品種提供選擇親本的依據(jù)。

對(duì)收集、保存的10份新疆薔薇屬野生資源和4個(gè)月季品種進(jìn)行了白粉病抗性評(píng)價(jià)，其中彎刺薔薇2號(hào)、尖刺薔薇表現(xiàn)出了很高的白粉病抗性，且表現(xiàn)均優(yōu)于供試的月季品種，說明了新疆野生薔薇屬資源中包含著重要的抗白粉病種質(zhì)資源，可以作為優(yōu)良親本用于現(xiàn)代月季新品種的培育工作，以期得到觀賞性狀優(yōu)良、具有較高抗病性的月季新品種。本試驗(yàn)中，彎刺薔薇4個(gè)不同群體的白粉病抗性差異較大，其中彎刺薔薇2號(hào)為高抗材料，彎刺薔薇3號(hào)和彎刺薔薇4號(hào)為中抗材料，而彎刺薔薇1號(hào)為高感材料。即同一野生種的不同株系表現(xiàn)出了抗病的異質(zhì)性，此現(xiàn)象同樣普遍存在于小麥［19］和葡萄［20］的野生種中。

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