銀條α-低聚半乳糖的免疫調(diào)節(jié)作用研究

馬麗蘋(píng)，秦翠麗，邱智軍，尤曉顏，曾曉雄

(1.河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南洛陽(yáng)471023;2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇南京210095)

低聚糖又稱(chēng)寡糖，是由2～10 個(gè)單糖通過(guò)糖苷鍵連接形成直鏈或支鏈的低度聚合糖，按照其能否被人體胃酸和胃酶所降解，并對(duì)人體有無(wú)特殊的生理功能可分為普通低聚糖和功能性低聚糖。普通低聚糖包括蔗糖、乳糖、麥芽糖、海藻糖和麥芽三糖等，它們可被機(jī)體胃腸內(nèi)的消化酶所水解并消化吸收，主要作用是提供人體活動(dòng)所需的能量和賦予食品怡人的甜味［1］。功能性低聚糖包括低聚異麥芽糖、大豆低聚糖、低聚果糖、低聚半乳糖、殼低聚糖、低聚木糖等，因其單糖分子間結(jié)合位置比較特殊，在人體腸道內(nèi)不具備相應(yīng)的分解消化的酶系統(tǒng)，不能被人體胃酸和胃酶所降解，在小腸內(nèi)不能被消化吸收，而是直接進(jìn)入大腸主要被有益菌雙歧桿菌所利用，發(fā)揮眾多 的 生 理 功 能［2-3］。α - 低 聚 半 乳 糖(α -Galactooligosaccharides，α-GOS)是功能性低聚糖的一種，它是一類(lèi)含有α-半乳糖苷鍵的低分子量可溶性低聚糖，其主要的獲取途徑是從大豆、羽扇豆和鷹嘴豆等豆科植物中提取［4-5］。目前市場(chǎng)上的α-GOS產(chǎn)品主要是大豆低聚糖，其主要成分是蔗糖、棉籽糖和水蘇糖，且已被應(yīng)用于飲料、酸奶、保健食品等領(lǐng)域。銀條(Stachys floridana Schuttl.ex Benth)是唇形科水蘇屬多年生宿根草本植物，其根狀莖呈圓柱形且細(xì)長(zhǎng)，肉質(zhì)潔白，酷似白銀，主產(chǎn)于華北、華南和新疆等地，多處于半野生狀態(tài)。作為蔬菜，人工栽培主要集中在河南偃師，占全國(guó)栽培總量的95%以上［6］。據(jù)偃師縣志記載，自唐代以來(lái)，銀條就已作為歷代宮廷貢品。銀條富含碳水化合物、多酚、VC、蛋白質(zhì)和有機(jī)酸，具有降血脂、軟化血管和改善血液循環(huán)的作用［7］。最近鐘先鋒等研究發(fā)現(xiàn)銀條中含有蔗糖、棉籽糖和水蘇糖等α-低聚半乳糖［8］，且已有研究發(fā)現(xiàn)功能性低聚糖具有提高機(jī)體免疫能力的活性［9-12］，但關(guān)于銀條α-低聚半乳糖的免疫調(diào)節(jié)活性至今尚未見(jiàn)到有關(guān)報(bào)道。因此，本研究擬采用環(huán)磷酰胺(CTX)免疫抑制小鼠模型評(píng)價(jià)銀條α-GOS 的免疫調(diào)節(jié)活性，為銀條α-GOS 生理功能的闡明及綜合利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

銀條 2009 年12 月購(gòu)于偃師市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，用去離子水清洗干凈，50℃烘干后，粉碎過(guò)60 目篩，保存在自封袋中備用;注射用CTX 江蘇恒瑞制藥有限公司;鹽酸左旋咪唑 濟(jì)南奧德凱藥業(yè)有限公司;二硝基氟苯 成都西亞試劑有限公司;溶菌酶、BCA-100 蛋白質(zhì)定量檢測(cè)試劑盒 南京建成生物工程研究所;蔗糖 瑞士Fluka 公司;棉籽糖 德國(guó)Merck公司;水蘇糖 美國(guó)Sigma 公司。

HH-4 型數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國(guó)華電器有限公司;TDL-5 型臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;Laborota-400 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 德國(guó)Heidolph 公司;SHB-Ⅲ型循環(huán)水式真空泵 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司;DHG-9140A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科技有限公司;TYL-350 型組織勻漿機(jī) 山東九陽(yáng)小家電有限公司;D-101 大孔吸附樹(shù)脂 江蘇九天樹(shù)脂科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 銀條α-GOS 的提取及初步純化 將100g 銀條干粉按15∶1 液料比用60%乙醇在50℃條件下浸提2 次，每次40min，然后合并乙醇提取液，50℃真空濃縮至干，用蒸餾水復(fù)溶后凍干。然后將銀條低聚糖凍干樣配成濃度為20mg/mL 的水溶液，上樣于D-101大孔吸附樹(shù)脂，用去離子水以1mL/min 的速度進(jìn)行線性洗脫，采用硫酸-苯酚法隔管檢測(cè)洗脫液中的總糖含量，合并相同組分，50℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，真空冷凍干燥，得初步純化樣品31.54g，故銀條α-GOS的得率為31.54%。

1.2.2 銀條α-GOS 含量的測(cè)定 采用高效液相色譜外標(biāo)法測(cè)定樣品中的低聚糖含量。

糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備:準(zhǔn)確稱(chēng)取蔗糖、棉籽糖、水蘇糖的標(biāo)準(zhǔn)樣品，用水溶解后，加入等量的乙腈，配制成一系列不同濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)0.45μm 針頭式有機(jī)系濾膜過(guò)濾后，按濃度從低到高的順序進(jìn)行HPLC 檢測(cè)，得到各個(gè)糖的保留時(shí)間，并記錄各個(gè)濃度對(duì)應(yīng)的峰面積，以峰面積對(duì)濃度作圖，得到各個(gè)糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線。蔗糖、棉籽糖、水蘇糖標(biāo)準(zhǔn)曲線分別為:y = 300106x-59887，R2= 0.9999;y = 231018x-79765，R2=0.9998;y =162331x +84737，R2=0.9996。其中y 代表各標(biāo)準(zhǔn)糖峰面積，x 代表糖濃度(mg/mL)。

對(duì)提取得的銀條α-GOS 進(jìn)行HPLC 分析，色譜柱:Hypersil 氨基柱，4.6 ×250mm，內(nèi)徑5μm;檢測(cè)器:RID;柱溫:40℃;流動(dòng)相:乙腈∶水=70∶30(v/v);流速:1.0mL/min;進(jìn)樣量:20μL。標(biāo)準(zhǔn)曲線HPLC 分析條件同上。

1.2.3 銀條α-GOS 對(duì)免疫抑制小鼠的免疫調(diào)節(jié)活性

1.2.3.1 動(dòng)物分組及實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 選取6 周齡、體重(BW)(18 ±2)g ICR 雌性小白鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)5d 后，隨機(jī)分成6 組，每組8 只?？瞻捉M:每天1 次腹腔注射生理鹽水0.5mL，共8d;模型組:每天1 次腹腔注射生理鹽水0.5mL，共8d，實(shí)驗(yàn)的第2、3、4d，在注射生理鹽水10h 后，按劑量100mg/kg BW 腹腔CTX 一次;陽(yáng)性組:每天1 次腹腔注射鹽酸左旋咪唑7mg/kg，共8d。

低劑量組、中劑量組和高劑量組，每天腹腔注射劑量分別為50、100、200mg/kg BW 的銀條α-GOS 樣品1 次，實(shí)驗(yàn)的第2、3、4d，在注射銀條α-GOS 樣品后10h 后，按劑量100mg/kg BW 腹腔注射CTX 一次，共8d。末次給藥12h 后，頸椎脫臼法處死小鼠，測(cè)定脾指數(shù)、胸腺指數(shù)、遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)和血清中溶菌酶活性。

1.2.3.2 銀條α-GOS 對(duì)免疫抑制小鼠免疫器官的影響 小鼠處死后解剖并摘取脾臟、胸腺，用生理鹽水洗去血漬，用濾紙吸去表面水分后稱(chēng)重，脾臟稱(chēng)重后立即置于冰上，待后期處理。按以下公式計(jì)算臟器指數(shù):

臟器指數(shù)(mg/g)=W1/W0

式中:W0為小鼠體重(g)，W1為臟器重量(mg)。

1.2.3.3 銀條α-GOS 對(duì)小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)(DTH)的影響［13］在給藥的第3d，小鼠腹部剪去小塊毛發(fā)，面積約3cm×3cm，將小鼠腹部朝上平放，用移液槍吸取1%二硝基氟苯30μL(丙酮與植物油1∶1 配比后配制二硝基氟苯溶液)分兩次緩慢滴加至去毛部位，待藥物被腹部皮膚吸收后，將小鼠放回鼠籠。在給藥后第7d 晚上，用1%二硝基氟苯20μL 均勻涂擦小鼠右耳兩側(cè)，左耳不擦作為對(duì)照。末次給藥后12h，將小鼠脫頸椎處死后，用打孔器將左右耳片分別打孔(直徑6mm)，取圓形耳片稱(chēng)重，計(jì)算耳腫脹度。

耳腫脹度(%)=(W1-W0)/W0×100

其中:W0為左耳重量(g)，W1為右耳重量(g)。

1.2.3.4 銀條α-GOS 對(duì)小鼠血清中溶菌酶的影響 用試劑盒測(cè)定血清中溶菌酶含量，具體操作按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2 結(jié)果與討論

2.1 銀條α-GOS 的制備及其含量測(cè)定

根據(jù)不同糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程，計(jì)算得出本實(shí)驗(yàn)提取得到的銀條α-GOS 含量。本實(shí)驗(yàn)選用的銀條其α-GOS 主要有蔗糖、棉籽糖、水蘇糖等組成見(jiàn)圖1～圖2。其中水蘇糖含量最高，約占可溶性總糖的65.72%;其次是蔗糖，約占總糖的5.68%;最后是棉籽糖，約占4.99%。從結(jié)果可以看出，銀條α-GOS的含量為76.39%，銀條中主要的α-GOS 是水蘇糖，其含量約占總α-GOS 含量的86.03%。

2.2 銀條α-GOS 的免疫調(diào)節(jié)作用

2.2.1 銀條α- GOS 對(duì)小鼠免疫器官指數(shù)的影響 銀條α-GOS 對(duì)小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)的影響見(jiàn)表1。與空白組相比，CTX 模型組的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)均顯著降低(p ＜0.05)，說(shuō)明CTX 免疫抑制模型建模成功。與CTX 模型組相比，不同劑量的銀條α-GOS均能顯著的提高CTX 免疫抑制小鼠的脾臟指數(shù)(p ＜0.05)，尤其在中、高劑量范圍時(shí)，CTX 免疫抑制小鼠的脾臟指數(shù)比正常小鼠的脾臟指數(shù)還高，說(shuō)明銀條α-GOS 能夠使因CTX 誘導(dǎo)產(chǎn)生的脾臟指數(shù)下降得以恢復(fù)，在一定程度上提高了機(jī)體的免疫力。然而，與模型組相比，不同劑量的銀條α-GOS 均不能使CTX 引起的小鼠胸腺指數(shù)下降得以恢復(fù)，究其原因，就目前所掌握的資料尚未看到有明確合理的解釋?zhuān)虼擞写乱徊缴钊胙芯?。胸腺和脾臟是機(jī)體主要的外周免疫器官，它們的重量從一定程度上反映了免疫器官內(nèi)淋巴細(xì)胞的數(shù)量，從而間接了解體內(nèi)淋巴細(xì)胞總體水平。而免疫器官指數(shù)不僅能很好的反映機(jī)體免疫器官的重量變化，且能將個(gè)體差異的影響降到最低限度［14］。所以，一般免疫藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)常以其作為反映機(jī)體免疫功能的最常規(guī)的指標(biāo)［15］。本研究結(jié)果表明銀條α-GOS 能夠提高CTX免疫抑制小鼠的脾臟指數(shù)，因此在一定程度上提高了小鼠的免疫能力。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)糖的HPLC 圖譜Fig.1 HPLC chromatography of standard sugar

圖2 銀條α-GOS 的HPLC 圖譜Fig.2 HPLC chromatography of α-GOS from S.floridana Schuttl.ex Benth

2.2.2 銀條α-GOS 對(duì)小鼠DTH 的影響 銀條α-GOS對(duì)小鼠DTH 的耳腫脹度的影響列于表1 中。從表1 中可以看出，CTX 模型組與空白組相比，耳腫脹度顯著減少(p ＜0.05)，說(shuō)明CTX 免疫抑制模型建模成功。而陽(yáng)性藥物和不同濃度的銀條α-GOS 處理均顯著地提高DTH 的耳腫脹度(p ＜0.05)，且這種變化與銀條α-GOS 呈現(xiàn)劑量依賴(lài)關(guān)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明銀條α-GOS 可以使因CTX 誘導(dǎo)產(chǎn)生的DTH 的耳腫脹度下降得以恢復(fù)。DTH 是由效應(yīng)T 細(xì)胞與相應(yīng)抗原作用后，引起的以單個(gè)核浸潤(rùn)和組織細(xì)胞損傷壞死為主要特征的炎癥反應(yīng)，是細(xì)胞免疫反應(yīng)的一種特殊表現(xiàn)，是檢測(cè)細(xì)胞免疫功能的常用方法之一。二硝基氟苯是一種半抗原，將其稀釋液涂抹于皮膚后，可與皮膚蛋白結(jié)合成完全抗原，由此刺激T淋巴細(xì)胞增殖成致敏淋巴細(xì)胞，4～7d 后再將其涂抹于耳部進(jìn)行抗原攻擊，局部可產(chǎn)生DTH 而出現(xiàn)腫脹。一般抗原攻擊后24～48h 達(dá)到高峰，測(cè)定其腫脹程度可以反映出DTH 程度［16］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明銀條α-GOS能夠提高免疫抑制小鼠的耳腫脹度，因此在一定程度上表明銀條α-GOS 具有提高免疫抑制小鼠T 淋巴細(xì)胞免疫水平的能力。

表1 銀條α-GOS 對(duì)小鼠脾臟指數(shù)，胸腺指數(shù)和耳腫脹度的影響Table 1 Effects of α-GOS from Stachys floridana Schuttl.ex Benth on spleen index，thymus index and swelling rate of ear

2.2.3 銀條α-GOS 對(duì)小鼠血清中溶菌酶活性的影響 銀條α-GOS 對(duì)小鼠血清中溶菌酶活性的影響如圖3。從圖3 中可以看出，與空白組相比，CTX 模型組血清中的溶菌酶含量顯著降低(p ＜0.05)，表明CTX 免疫抑制模型建模成功。小鼠腹腔注射中、高劑量的銀條α-GOS 后，與空白組和模型組的小鼠相比，其血清中的溶菌酶含量極顯著上升，且這種變化與劑量呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系，即溶菌酶活性隨劑量的上升而上升，在劑量為200mg/kg BW 時(shí)達(dá)到最高值(653.33 ±47.94)U/mL。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，腹腔注射銀條α-GOS 可以顯著地提高免疫抑制小鼠血清中溶菌酶活性，使其中溶菌酶活性恢復(fù)并超過(guò)正常水平。溶菌酶(Iysozyme)又稱(chēng)胞壁酶(muramidase)或 N - 乙酰胞壁質(zhì)聚糖水解酶 (N -acetylmuramideglycanohydrase)，是一種能水解致病菌中黏多糖的堿性酶。溶菌酶廣泛存在于鳥(niǎo)類(lèi)、家禽的蛋清中和哺乳動(dòng)物的淚液、唾液、血漿、乳汁、胎盤(pán)、體液以及組織細(xì)胞內(nèi)，其中蛋清中的含量最豐富(約0.3%)［17］。溶菌酶具有抗菌、消炎、抗病毒、抗腫瘤和增強(qiáng)機(jī)體免疫力等作用［18］，因此在機(jī)體的正常防御功能和非特異性免疫中，占有重要地位。因此，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明銀條α-GOS 可以在體內(nèi)通過(guò)提高溶菌酶活性而提高機(jī)體的非特異免疫能力。

圖3 銀條α-GOS 對(duì)小鼠血清中溶菌酶活性的影響Fig.3 Effect of α-GOS from Stachys floridana Schuttl.ex Benth on the activity of lysozyme in mice serum

3 結(jié)論

以銀條為原料，制備得主要由蔗糖、棉籽糖和水蘇糖組成的銀條α-GOS，含量為76.39%，其中水蘇糖約占總α-GOS 的86.03%。免疫調(diào)節(jié)作用研究結(jié)果表明:銀條α-GOS 可以顯著地提高CTX 免疫抑制小鼠的脾臟指數(shù)、DTH 的耳腫脹度和血清中溶菌酶的活性，表明銀條α-GOS 具有一定的免疫調(diào)節(jié)能力。

［1］黃德娟，談華平.功能性低聚糖［J］.生物學(xué)通報(bào)，2005，40:19-21.

［2］單黎然，龔月樺，賈建光，等.4 種重要功能性低聚糖的研究進(jìn)展［J］.西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2006，34(7):96-100.

［3］Kaneko T，Yokoyama A，Suzuki M.Digestibility characteristics of isomalto oligosaccharides in comparison with several saccharides using the rat jejunum loop method［J］. Biosci Biotechnol Biochem，1995，59(7):1190-1194.

［4］賀晉艷，張蕓，李偉，等.鷹嘴豆α-低聚半乳糖的腸道益生功能［J］.食品科學(xué)，2011，32(15):94-98.

［5］羅存回，賀晉艷，曾曉雄.鷹嘴豆α-低聚半乳糖的穩(wěn)定性和美拉德反應(yīng)特性［J］.食品科學(xué)，2011，32(23):91-95.

［6］程智慧，孟煥文，周文安，等.地靈高產(chǎn)栽培［J］.西北園藝，2003(1):30-32.

［7］李素云，梁中麗，董鐵有.調(diào)壓法凍干銀條工藝研究［J］.糧食流通技術(shù)，2010，2:35-37.

［8］陳燕，鐘先鋒，黃桂東，等.銀條水蘇糖提取條件研究［J］.天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)，2011，23(1):123-130.

［9］徐超斗，梁愛(ài)君，祝業(yè)，等.大豆低聚糖對(duì)免疫功能的促進(jìn)作用［J］.解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào)，2005，21(1):37-39.

［10］賈士奇，黃霞，劉惠霞.山藥低聚糖的免疫增強(qiáng)作用［J］.河南大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2009，28(1):44-45，48.

［11］王中華，黃修奇，郭全海.大棗低聚糖對(duì)雛雞生長(zhǎng)性能和免疫功能的影響［J］.中國(guó)飼料，2011(19):25-27.

［12］王秒，白玉，李鋼，等.胭脂樹(shù)低聚糖增強(qiáng)小鼠免疫功能的研究［J］.實(shí)用中西醫(yī)結(jié)合臨床，2011，11(3):88，91.

［13］Qiao D，Luo J，Ke C，et al.Immunostimulatory activity of the polysaccharides from Hyriopsis cumingii［J］.International Journal of Biological Macromolecules，2010，47(5):676-680.

［14］王秀青，朱明星，張愛(ài)君，等.抗菌肽CecropinB 對(duì)雞生長(zhǎng)發(fā)育及免疫功能的影響［J］.寧夏醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，32(1):39-41，46.

［15］麻名文，李福昌.日糧精氨酸水平對(duì)斷奶2 月齡肉兔生長(zhǎng)性能、免疫器官指數(shù)及血清指標(biāo)的影響［J］.動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，2009，21(3):405-410.

［16］毛跟年，許牡丹.功能食品生理特性與檢測(cè)技術(shù)［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005:387-394.

［17］陳艷，江明鋒，葉煜輝，等.溶菌酶的研究進(jìn)展［J］.生物學(xué)雜志，2009，26(2):64-66.

［18］劉淑鑫，李萇清，袁新華，等.溶菌酶醫(yī)學(xué)應(yīng)用研究概況［J］.中國(guó)醫(yī)藥指南，2011，9(21):226-228.