稠李屬三種果實(shí)花色苷對HepG2 細(xì)胞的增殖抑制作用比較

辛 越，劉 榮 ，何 嬌，臧 云

(東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江哈爾濱150040)

稠李(Padus racemosa)、山桃稠李(Prunus maackii)又名斑葉稠李，紫葉稠李 (Padus virginiana)，為薔薇科(Rosaceae)稠李屬的三種植物，主要分布于北溫帶，多年生落葉喬木［1］?；ㄆ谠?～6月，總狀花序，花瓣密集呈白色，果期在5～10 月，果實(shí)未成熟時(shí)呈綠色，味澀，成熟后呈紫黑色，味甜，肉多、汁多，果核堅(jiān)硬［2］。稠李屬植物因較耐濕寒，在我國黑龍江、吉林、遼寧、內(nèi)蒙古、河北、山西、河南、山東等地均有分布，樹皮、葉、花和果可入藥，樹干可做木材，用途廣泛，并花香濃郁，為早春觀賞植物之一［3］。近年來，隨著人們對保健意識的逐漸增強(qiáng)，逐漸發(fā)現(xiàn)食品中的合成色素對人體具有潛在的危害，有些甚至能夠致癌，已禁止使用。天然色素不但色澤自然，安全可靠，而且有些還具有一定的保健和藥理作用，已越來越受到人們的關(guān)注［4］。植物色素多為花色苷類、黃酮類化合物、番茄紅素類、胡蘿卜素類，具有生物活性，可作為保健食品中的功能性有效成分［5］。而植物中提取的花色苷因其無毒害而被人們所關(guān)注，較多研究認(rèn)為花色苷不但具有抗氧化、抗疲勞的作用，還具有較強(qiáng)的抗癌活性，具有抑制腫瘤增殖的作用［6］。腫瘤細(xì)胞的主要特征是具有無限的增殖能力，喪失了正常細(xì)胞的凋亡功能，以人腫瘤細(xì)胞進(jìn)行體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)已成為檢測細(xì)胞毒性以及篩選抗腫瘤藥物的主要的手段［7］，同時(shí)也能為判斷植物提取物是否具有抗腫瘤的潛能提供最基礎(chǔ)的數(shù)據(jù)［8］。稠李屬的果實(shí)花色苷為天然植物提取物，具有抗氧化活性［9］，國內(nèi)對稠李屬植物的研究也多為生長特性及苗木繁育等方面［10-11］，而對稠李屬果實(shí)花色苷對腫瘤增殖抑制的研究還未見報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

肝癌HepG2 細(xì)胞 哈醫(yī)大腫瘤醫(yī)院;小牛血清 杭州四季青;噻唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞砜(DMSO) sigma 進(jìn)口分裝;改良型RPMI 1640 培養(yǎng)基 賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司;胰蛋白酶 Sigma公司;雙抗試劑(100U/mL 青霉素、100μg/mL鏈霉素) 北京索萊寶試劑公司。

DF-110 電子分析天平 中國輕工業(yè)機(jī)械總公司;GL-16G-C 高速冷凍離心機(jī) 上海科興儀器有限公司;低溫冰箱 FORMA 公司美國;SW-CJ-IC 超凈工作臺 中國蘇州;酶標(biāo)儀 Biocell 公司美國;CO2培養(yǎng)箱 Thermo Forma 公司;倒置顯微鏡 Nikon 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 花色苷的制備 分別取三種稠李果適量，剪枝、榨汁，同pH2 的酸化乙醇按照料液比1∶4(W∶V)混合，提取2 次，每次提取12h，合并提取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇后，經(jīng)X-5 大孔樹脂上柱純化，減壓濃縮，真空冷凍干燥得到稠李屬三種果實(shí)花色苷粉末，-20℃保存。實(shí)驗(yàn)時(shí)分別將三種果實(shí)花色苷用PBS緩沖液稀釋到一定濃度，0.22μm 濾膜過膜備用［12］。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)液的配制 改良型RPMI 1640 基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，加入1% 的l00U/mL 青霉素，100μg/mL鏈霉，以及10%的滅活胎牛血清。

1.2.3 細(xì)胞的復(fù)蘇與培養(yǎng) 從液氮中取出凍存的HepG2 細(xì)胞迅速放入37℃水浴1min，并不斷搖動(dòng)使其解凍。1000r/min 離心5min，吸棄上清液，培養(yǎng)于改良型RPMI 1640 培養(yǎng)基中加入l00U/mL 青霉素，100μg/mL 鏈霉素以及10%的滅活胎牛血清的培養(yǎng)液中。將細(xì)胞置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，HepG2 細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)瓶貼壁生長，每種培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞均大于3 次，每3～4d 傳代一次。

1.2.4 細(xì)胞生長抑制曲線 依據(jù)文獻(xiàn)［13］方法并有所改動(dòng)，將HepG2 以1.0 ×105個(gè)細(xì)胞/mL 的密度，每孔1mL，接種于96 孔培養(yǎng)板，放入37℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)6h 待細(xì)胞貼壁生長良好后，加入不同質(zhì)量濃度(0.05～1.2mg/mL)的花色苷培養(yǎng)，收集培養(yǎng)24、48、72h 的細(xì)胞，胎盤藍(lán)染色，在3min 內(nèi)，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板在普通光學(xué)顯微鏡下記數(shù)活細(xì)胞和死細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)重復(fù)五次，并繪制細(xì)胞生長曲線。

1.2.5 MTT 法檢測HepG2 細(xì)胞生長抑制率 參照文獻(xiàn)［14］，取對數(shù)生長期的HepG2 細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后，調(diào)整細(xì)胞密度為1 ×105個(gè)細(xì)胞/mL，接種于96 孔培養(yǎng)板，每孔100μL，將未經(jīng)處理的細(xì)胞作為對照組，加入不同濃度花色苷的細(xì)胞作為處理組，只加花色苷和培養(yǎng)液而不含細(xì)胞的為空白組。其中處理組、對照組、處理組及空白組每個(gè)濃度各設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24、48、72h 后，每孔加入10μL MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄上清液，每孔加入150μL DMSO，利用酶標(biāo)儀在490nm 測A 值，并計(jì)算細(xì)胞的生長抑制率。公式如下:

細(xì)胞生長抑制率(%)=［1-(處理組A 值-空白組A 值)/(對照組A 值-空白組A 值)］×100

以花色苷濃度為橫軸，細(xì)胞抑制率為縱軸，繪制生長抑制曲線，并計(jì)算半數(shù)抑制濃度(median inhibitory concentration，IC50)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

作圖采用Origin8.0 軟件，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件，One-Way ANOVA 進(jìn)行處理和顯著性分析檢驗(yàn)，在p ＞0.05 水平上差異不顯著;在p ＜0.05 水平上差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞生長抑制曲線結(jié)果

HepG2 細(xì)胞是高度分化的人肝癌細(xì)胞株，保存了很多正常人肝細(xì)胞的代謝特點(diǎn)，其生物學(xué)特性也與正常肝細(xì)胞相近，易于培養(yǎng)，比較穩(wěn)定［15］，所以本實(shí)驗(yàn)使用HepG2 細(xì)胞作為受試細(xì)胞。在實(shí)驗(yàn)中，胎盤藍(lán)將死細(xì)胞被染為藍(lán)色，而活細(xì)胞拒染。

2.1.1 紫葉稠李果花色苷對HpG2 細(xì)胞生長曲線的影響 紫葉稠李的不同濃度花色苷作用人肝癌HepG2 細(xì)胞24h 后，各組的活細(xì)胞數(shù)量產(chǎn)生差異，并且隨著時(shí)間的延長各組的活細(xì)胞數(shù)目差異逐漸增大，與時(shí)間呈依賴性效應(yīng)關(guān)系。由圖1 可知，0.4、0.8、1.2mg/mL 處理組活細(xì)胞數(shù)量與對照組相比顯著減少，顯示出細(xì)胞大量死亡;而0.1、0.2mg/mL 處理組雖較對照組生長緩慢，但活細(xì)胞依然呈現(xiàn)增長的狀態(tài)，與對照組相比抑制細(xì)胞的增殖程度并不大;從圖中還可以看出0.05mg/mL 處理組活細(xì)胞數(shù)量遞增，且在24、48、72h 均大于對照組活細(xì)胞數(shù)，提示0.05mg/mL 的紫葉稠李果實(shí)花色苷對HepG2 細(xì)胞具有一定的增殖作用。

圖1 紫葉稠李果花色苷對HpG2 細(xì)胞生長曲線的影響Fig.1 The effect of anthocyanin extracted from Padus Virginiana on the proliferation curve of HepG2 cell

2.1.2 山桃稠李果花色苷對HpG2 細(xì)胞生長曲線的影響 由圖2 可知，在山桃稠李的不同濃度花色苷作用人肝癌HepG2 細(xì)胞24h 后，各處理組細(xì)胞增殖均低于對照組，呈現(xiàn)出濃度依賴性和時(shí)間依賴性效應(yīng)關(guān)系。質(zhì)量濃度大于0.2mg/mL 處理組與對照組相比具有顯著性差異，能夠顯著降低HepG2 細(xì)胞活力，但0.05、0.1mg/mL 對活細(xì)胞的作用依然較低，表明0.1mg/mL 以下濃度的山桃稠李花色苷雖能抑制HepG2 細(xì)胞快速增殖，但細(xì)胞增殖率降低程度不大。

圖2 山桃稠李果花色苷對HpG2 細(xì)胞生長曲線的影響Fig.2 The effect of anthocyanin extracted from Prunus maackii on the proliferation curve of HepG2 cell

2.1.3 稠李果花色苷對HpG2 細(xì)胞生長曲線的影響

由圖3 可知，稠李的不同濃度花色苷作用人肝癌HepG2 細(xì)胞24h 后，各處理組細(xì)胞增殖均低于對照組，與對照組相比，活細(xì)胞數(shù)量花色苷濃度的增大以及時(shí)間的延長呈下降的趨勢。質(zhì)量濃度大于0.1mg/mL 的處理組對HpG2 細(xì)胞生長抑制顯著，而質(zhì)量濃度為0.05mg/mL 的處理組，對細(xì)胞增殖抑制相對較低。

圖3 稠李果花色苷對HpG2 細(xì)胞生長曲線的影響Fig.3 The effect of anthocyanin extracted from Padus racemosa on the proliferation curve of HepG2 cell

腫瘤細(xì)胞生長的顯著特點(diǎn)是快速增殖且不受控制，但當(dāng)細(xì)胞所處的環(huán)境發(fā)生改變時(shí)，細(xì)胞形態(tài)也會發(fā)生的相應(yīng)變化甚至引起細(xì)胞凋亡［16］。本實(shí)驗(yàn)探討不同濃度的花色苷作用于人肝癌HepG2 細(xì)胞24、48、72h 后，胎盤藍(lán)染色，在倒置顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)，發(fā)現(xiàn)相對高的濃度(0.1～1.2mg/mL)的三種果實(shí)花色苷均能抑制細(xì)胞生長，而低濃度(0.05mg/mL)的紫葉稠李果花色苷能夠促進(jìn)細(xì)胞生長。而本實(shí)驗(yàn)探討的是三種果實(shí)花色苷對HepG2 細(xì)胞的增殖抑制作用，由此實(shí)驗(yàn)結(jié)果，下述實(shí)驗(yàn)去除質(zhì)量濃度為0.05mg/mL 的處理組。

2.2 MTT 法檢測花色苷對HepG2 細(xì)胞生長抑制率

四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT 法)的原理是在活細(xì)胞內(nèi)的線粒體琥珀酸脫氫酶可將MTT 還原成藍(lán)紫色甲瓚，而其形成的量與活細(xì)胞數(shù)量成正比關(guān)系。該法已被應(yīng)用于細(xì)胞系的體外抗癌藥物篩選，由于MTT 是比色測定，故花色苷本身的顏色也會干擾結(jié)果的準(zhǔn)確性［17］，所以必須排除花色苷本身的顏色對MTT 實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。

2.2.1 紫葉稠李果實(shí)花色苷對HepG2 細(xì)胞生長抑制率 紫葉稠李果實(shí)花色苷分別作用HepG2 細(xì)胞后，結(jié)果如表1 所示。隨著花色苷濃度的升高，以及作用時(shí)間的延長，對HepG2 細(xì)胞增殖的抑制作用都逐漸增強(qiáng)，表現(xiàn)出明顯的劑量效應(yīng)和時(shí)間效應(yīng)。與對照組(未經(jīng)處理的細(xì)胞)相比差異性顯著(p ＜0.05)，表明紫葉稠李花色苷能抑制HepG2 細(xì)胞生長增殖，降低細(xì)胞活性。并且當(dāng)質(zhì)量濃度為1.2mg/mL 紫葉稠李果實(shí)花色苷處理HepG2 細(xì)胞24、48、72h 后，抑制率分別為(40.97 ± 4.92)%、(52.76 ± 3.36)%、(57.22 ±2.29)%。

表1 MTT 法檢測紫葉稠李果實(shí)花色苷對HepG2 細(xì)胞抑制率Table 1 Inhibition of the anthocyanin extracted from Padus Virginiana on the proliferation of HepG2 cell tested by MIT

2.2.2 山桃稠李果實(shí)花色苷對HepG2 細(xì)胞生長抑制率 山桃稠李果實(shí)花色苷分別作用HepG2 細(xì)胞后，結(jié)果如表2 所示。隨著花色苷濃度的升高，以及作用時(shí)間的延長，對HepG2 細(xì)胞增殖的抑制作用都逐漸增強(qiáng)，并稱濃度依賴與時(shí)間依賴。與對照組(未經(jīng)處理的細(xì)胞)相比差異性顯著(p ＜0.05)，并且在同一時(shí)間點(diǎn)各濃度之間，同一濃度各時(shí)間點(diǎn)之間，山桃稠李果實(shí)花色苷對HepG2 細(xì)胞的抑制率均有顯著差異(p ＜0.05)。當(dāng)質(zhì)量濃度為1.2mg/mL 山桃稠李果實(shí)花色苷處理HepG2 細(xì)胞24、48、72h 后，抑制率分別為(45.77 ± 3.68)%、(58.23 ± 2.21)%、(61.19 ±4.65)%，抑制率均大于紫葉稠李。

表2 MTT 法檢測山桃稠李果實(shí)花色苷對HepG2 細(xì)胞抑制率Table 2 Inhibition of the anthocyanin extracted from Prunus maackii on the proliferation of HepG2 cell tested by MIT

2.2.3 稠李果實(shí)花色苷對HepG2 細(xì)胞生長抑制率 稠李果實(shí)花色苷分別作用HepG2 細(xì)胞后，結(jié)果如表3 所示。在0.1～1.2mg/mL 濃度范圍內(nèi)，隨著花色苷濃度的增加，其抑制率逐漸增大。且隨著時(shí)間的延長，抑制率也逐漸升高。抑制規(guī)律與前兩種花色苷一樣，在同一時(shí)間點(diǎn)各濃度之間，同一濃度各時(shí)間點(diǎn)之間，稠李果實(shí)花色苷對HepG2 細(xì)胞的抑制率均有顯著差異(p ＜0.05)。當(dāng)質(zhì)量濃度為1.2mg/mL稠李果實(shí)花色苷處理HepG2 細(xì)胞24、48、72h 后，抑制率分別為(47.73 ± 1.67)%、(67.92 ± 2.78)%、(78.82 ± 4.13)%，抑制率均大于紫葉稠李、山桃稠李。

表3 MTT 法檢測稠李果實(shí)花色苷對HepG2 細(xì)胞抑制率Table 3 Inhibition of the anthocyanin extracted from Padus racemosa on the proliferation of HepG2 cell tested by MIT

2.2.4 稠李屬三種果實(shí)花色苷對HepG2 細(xì)胞增殖抑制作用比較 選取在質(zhì)量濃度為0.1～1.2mg/mL 范圍的三種果實(shí)花色苷分別作用HepG2 細(xì)胞48h 后的結(jié)果作圖，由圖4 所示，隨著三種果實(shí)花色苷濃度的升高對HepG2 細(xì)胞的增殖抑制作用都逐漸增強(qiáng)，表現(xiàn)出明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。通過計(jì)算得到的紫葉稠李、山桃稠李、以及稠李的IC50值分別為:1.07、0.82、0.64mg/mL。并且，在質(zhì)量濃度小于0.4mg/mL 時(shí)稠李、山桃稠兩種果實(shí)花色苷對HepG2 細(xì)胞抑制率高于紫葉稠李，差異顯著(p ＜0.05)，而稠李、山桃稠李差異不顯著(p ＞0.05)。在質(zhì)量濃度大于0.4mg/mL時(shí)稠李果實(shí)花色苷對HepG2 細(xì)胞抑制率明顯高于山桃稠李，且稠李屬的三種果實(shí)花色苷均差異顯著(p ＜0.05)。

圖4 三種果實(shí)花色苷對HepG2 細(xì)胞生長抑制率對比Fig.4 The inhibition of three kinds of anthocyanins effect on the proliferation of HepG2 cell

3 結(jié)論與討論

抑制癌細(xì)胞增殖被認(rèn)為是藥物具備抗癌效果的一個(gè)主要標(biāo)準(zhǔn)，而藥物對惡性腫瘤細(xì)胞的毒作用又通常與它們抑制細(xì)胞增殖的能力有關(guān)，所以通過藥物對細(xì)胞的毒性檢測對評估一種天然產(chǎn)物是否具有抗癌潛能有重要意義［18］。

通過對本實(shí)驗(yàn)的研究有如下分析:

3.1 由圖1～圖3 顯示三種果實(shí)花色苷對HepG2 細(xì)胞的生長都具有一定的影響。0.05mg/mL 的紫葉稠李果實(shí)花色苷能夠促進(jìn)HepG2 細(xì)胞的生長，其原因可能是紫葉稠李花色苷在低濃度時(shí)作為HepG2 細(xì)胞的營養(yǎng)物質(zhì)，而當(dāng)濃度提高到0.1mg/mL 才能夠?qū)epG2 細(xì)胞的增殖產(chǎn)生影響。

3.2 通過胎盤藍(lán)染色法和MTT 方法研究發(fā)現(xiàn)，0.1～1.2mg/mL 的花色苷處理HepG2 細(xì)胞24、48、72h 后，稠李屬三種果實(shí)花色苷對HepG2 細(xì)胞均具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性，且與濃度和時(shí)間具有依賴性。三種果實(shí)花色苷對HepG2 細(xì)胞生長抑制率的大小為:稠李＞山桃稠李＞紫葉稠李。說明HepG2 細(xì)胞對稠李屬的三種果實(shí)花色苷均比較敏感。

上述結(jié)果表明紫葉稠李、山桃稠李、稠李對HepG2 細(xì)胞具有潛在抗癌活性，可能與其改變細(xì)胞的抗氧化活性系統(tǒng)、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抗血管生成等活性有關(guān)［19-20］，機(jī)制尚不明確，有待進(jìn)一步的研究。

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