高效液相色譜法測定山楂中蘆丁、金絲桃苷和槲皮素的含量

王 珍，李秀霞，李 嬌，勵建榮

(渤海大學化學化工與食品安全學院，遼寧省食品安全重點實驗室，遼寧省高校重大科技平臺“食品貯藏加工及質(zhì)量安全控制工程技術(shù)研究中心”，遼寧錦州121013)

山楂(Crataegus pinnatifida Bge.)為藥食同源性藥材，根據(jù)藥效學研究，具有擴冠、強心、降壓、降脂作用，臨床廣泛用于治療冠心病(如舒血寧)及高脂血癥［1］。近年來國內(nèi)外學者針對黃酮物質(zhì)的檢測方法進行了很多研究，彭全才等［2-3］研究利用反相高效液相法同時檢測包括蘆丁、金絲桃苷和槲皮素在內(nèi)多種物質(zhì)含量的檢測方法，分離效果好，但是耗時在一個小時之內(nèi);張永超等［4］用高效液相檢測山楂中各種黃酮的含量，單標分別檢測;王光忠［5-6］等在30min內(nèi)同時檢測出蘆丁和金絲桃苷的含量。據(jù)國內(nèi)外研究成果表明［7-9］，山楂果實中含量最多的黃酮屬槲皮素類，包括蘆丁、金絲桃苷和槲皮素。鑒于此，筆者研究一種耗時短、重復(fù)性好、適合槲皮素類黃酮含量的快速檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蘆丁標準品 中國藥品生物制品檢定所;槲皮素標準品 中國藥品生物制品檢定所;金絲桃甙標準品 寶雞市辰光生物科技有限公司;高效液相色譜檢測所用試劑均為色譜純，水為超純水。

高效液相色譜儀P680 美國戴安公司;電子天平FA2004 上海恒平科學儀器有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-2000上海亞榮生化儀器廠;超純水機PS02-AD-DI 上海訊輝環(huán)?？萍加邢薰?。

1.2 實驗方法

1.2.1 待測樣品的提取 原料的處理 山楂→去核→50℃烘干→磨粉→過篩→成品→密封包裝

黃酮的提取方法:稱取山楂粉5g，用濾紙包好，放入索氏提取器，100mL 70% 乙醇［10］，回流提取5～8h，直至回流液無色為止。70℃減壓旋蒸濃縮，用甲醇定容于25mL 容量瓶中，待測。

1.2.2 高效液相色譜條件 色譜柱Develosil C30;流動相:A 相為乙腈，B 相為0.4%磷酸水溶液，梯度洗脫。B 相隨時間變化:80% ～60.5% (0 ～26min)，60.5%～80% (26 ～26.1min)，80% (26 ～30min)流速1mL/min;柱溫40℃，進樣20μL;檢測波長:360nm。

1.2.3 標準溶液的配制與曲線繪制 稱取適量各標準品，置于10mL 的容量瓶中，分別加入色譜級甲醇，超聲波助溶并定容至刻度，分別配成以下6 個濃度梯度的混合標準品溶液(見表1)，封口保存?zhèn)溆?。按照上述色譜條件進行HPLC 測定，做峰面積對濃度的標準曲線，求出直線回歸方程。

1.2.4 樣品分析 在相同的液相色譜條件下，分別將標準溶液和樣品溶液注入液相色譜儀中，以保留時間定性，以試樣峰面積與標準比較定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理條件的選擇

稱取山楂粉5g，用濾紙包好，放入索氏提取器，加入100mL 70%乙醇，回流5～8h，直至回流液無色為止。70℃減壓旋蒸濃縮，用甲醇定容于25mL 容量瓶中，0.45μm 膜過濾，待測。

2.2 色譜條件的選擇

本研究發(fā)現(xiàn)蘆丁、金絲桃苷和槲皮素在360nm處有最大吸收波長，且雜質(zhì)峰值小，流動相為乙腈和0.4%磷酸水溶液，流速為1mL/min;柱溫40℃，進樣20μL;檢測波長:360nm。山楂黃酮標準品色譜分離圖見圖1，山楂黃酮樣品色譜分離圖見圖2。圖1 中蘆丁、金絲桃苷和槲皮素三種物質(zhì)的光譜掃描圖像于圖的右側(cè)表示出，標準品的最大吸收波長能夠大致確定該標準品，圖2 樣品圖中，三種目標峰的出峰時間與標準品的出峰時間有所出入，但是借助光譜掃描圖譜能夠確定樣品中的三種峰確實是三種被測物質(zhì)。

2.3 標準曲線的建立

在規(guī)定的色譜條件下，將標準溶液進樣20μL進行測定，結(jié)果表明蘆丁在0.0005 ～0.16mg(R2=0.9999)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為y =538.31x-0.3226;金絲桃苷在0.0016～0.05mg(R2=0.9996)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為y =828.86x。槲皮素在0.0005 ～0.015mg(R2=0.9997)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為y = 550.85x+0.044。

圖1 黃酮標準品色譜分離圖Fig.1 Standard chromatographic separation of figure of flavonoids from hawthorn

表1 混合標準溶液中各標準品的濃度表Table 1 The table of the concentration of standard substance in the mixed standard solution

2.4 方法學考察

圖2 山楂黃酮樣品色譜分離圖Fig.2 Sample chromatographic separation of figure of flavonoids from hawthorn

2.4.1 精密度實驗 精密吸取對照品溶液，重復(fù)進樣6 次，按上述色譜條件進行測定，蘆丁、金絲桃苷、槲皮素的峰面積的RSD 分別為0.78%、0.48%、0.69%，表明該檢測方法精密度良好。結(jié)果見表2。

2.4.2 重現(xiàn)性實驗 取同一批號樣品按供試品溶液的制備方法平行制備5 份，按上述色譜條件進行測定，蘆丁的平均含量為1.886mg/g，金絲桃苷的平均含量為 1.148mg/g，槲皮素的平均含量為0.664mg/g。RSD 分別為1.1%、1.4%、1.6%，表明該方法重復(fù)性良好。

表2 精密度測定結(jié)果Table 2 Result of accuracy experiment

2.4.3 回收率實驗 稱取已知各黃酮成分含量的山楂樣品5g，準確加入蘆丁、金絲桃苷和槲皮素標準品，按照2.1 樣品液制備方法制備供試液。此測試液中黃酮成分的理論含量分別為:蘆丁1.886mg/g、金絲桃苷1.148mg/g、槲皮素0.664mg/g，重復(fù)測定3次，計算樣品的加樣回收率，實驗結(jié)果見表4。

2.5 樣品含量的測定

對樣品提取液檢測結(jié)果表明，山楂中蘆丁的含量為1.886mg/g，金絲桃苷的含量為1.148mg/g，槲皮素的含量為0.664mg/g。

3 結(jié)論

本實驗?zāi)康慕⒏咝б合嗌V法測定山楂總黃酮提取物中蘆丁、金絲桃苷和槲皮素的含量的方法。方法采用HPLC 法，色譜柱DevelosilC30;流動相:A相為乙腈，B 相為0.4%磷酸水溶液，梯度洗脫。B 相隨時間變化:80%～60.5%(0 ～26min)，60.5%～80%(26～26.1min)，80%(26.1～30min)流速1mL/min;柱溫40℃，進樣20μL;檢測波長:360nm。結(jié)果蘆丁在0.005～0.16mg(R2=0.9999)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為y =538.31x-0.3226，平均回收率為98.65%(RSD =0.383%);金絲桃苷在0.0016～0.05mg(R2=0.9996)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為y =828.86x，平均回收率為94.15%(RSD =0.685%)。槲皮素在0.0005～0.015mg(R2=0.9997)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為y =550.85x +0.0443，平均回收率為92.36%(RSD =0.306%)。

本實驗對山楂黃酮的分析方法進行了改進，三種黃酮標準品的色譜峰得到了很好的分離且出峰時間短，三種黃酮均為槲皮素類黃酮，這為今后其它槲皮素類黃酮物質(zhì)的高效液相檢測提供理論依據(jù)。

表3 重現(xiàn)性測定結(jié)果Table 3 Result of reproducibility experiment

表4 山楂黃酮回收率測定結(jié)果Table 4 Result of the recovery experiment of hawthorn flavone

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