響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助提取石榴籽中原花青素工藝的研究

李 茜，呂 萍，薛 波，孫瀟輝，丁之恩

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技學(xué)院，安徽合肥230036)

石榴(Punica granatum L.)又名海榴、若榴等，為石榴科石榴屬落葉灌木或小喬木，具有降血糖、血脂和抗菌、抗腫瘤等功效［1-2］。石榴汁中含豐富的維生素和礦物質(zhì)，如VA、VB1、VB2、VC、鈣、鐵、鉀、鋅等［3-4］;石榴籽中主要含有棕櫚酸、硬脂酸、亞油酸、油酸、花生酸、山崳酸、石榴酸、α-桐酸等脂肪酸［5］;果皮中富含黃酮類化合物。原花青素(Proanthocyanidins，PC)是從植物中分離得到，在酸性條件下經(jīng)醇加熱處理后能產(chǎn)生花色素的多酚類物質(zhì)，包括單體和聚合體:單體包含黃烷-4-醇和黃烷-3，4-二醇;聚合體由黃烷-3-醇的單體結(jié)構(gòu)單位聚合而成［6］。原花青素抗氧化活性極強(qiáng)，可清除人體自由基，降低毛細(xì)血管通透性，緩解心血管疾病，改善視覺功能，抗輻射，抗過敏，還具有皮膚保健及美容作用［7］。本實(shí)驗(yàn)以懷遠(yuǎn)石榴(薄皮糙品種)為原料，對(duì)其原花青素的提取工藝進(jìn)行探討，并利用響應(yīng)面法對(duì)提取參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，為石榴的深度開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

安徽懷遠(yuǎn)涂山石榴(品種:薄皮糙) 安徽省懷遠(yuǎn)縣涂山石榴專業(yè)合作社提供;原花青素標(biāo)準(zhǔn)品、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、乙腈、香草醛、濃硫酸、六偏磷酸鈉(SH)、HCl、NaOH 均為分析純。

ML204/02 精密電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;KQ-250DE 型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;GZX-9146 MBE 數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;UV-1800 紫外可見分光光度計(jì) 上海美諾達(dá)儀器有限公司;DL-5-B 飛鴿離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;RV10 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 廣州儀科實(shí)驗(yàn)室技術(shù)有限公司;DK-S24 型電熱恒溫水浴鍋 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;SHA-B 雙功能水浴恒溫振蕩器 金壇市杰瑞爾電器有限公司;FDU-2100 真空冷凍干燥機(jī) 上海愛朗儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立［8］配制0.1mg/mL 原花色素標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別吸取0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL 置于6 個(gè)10mL 容量瓶中，各加入乙醇溶液定容至10mL，各取1mL 于6 支試管中，分別加入2.5mL 3%香草醛乙醇溶液和2.5mL 30%硫酸乙醇溶液，搖勻后于30℃水浴保溫20min，然后在500nm 處測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 石榴籽原花青素的提?。?］將洗凈的石榴籽置于40℃烘箱內(nèi)干燥72h，取出粉碎，過40 目篩。精確稱取1.0g 石榴籽干粉于50mL 錐形瓶中，按要求加入一定量溶劑提取一段時(shí)間，離心，得到原花青素類物質(zhì)提取液。

1.2.3 石榴籽原花青素得率的測定［10］采用香草醛-硫酸法測定樣品中原花青素含量。取樣品溶液1mL 按標(biāo)線制作方法操作，于500nm 處測定吸光度，根據(jù)原花青素標(biāo)準(zhǔn)工作曲線計(jì)算出樣品中原花青素含量，并按下式計(jì)算出原花青素得率。

得率(%)= 樣品中原花青素含量/樣品質(zhì)量×100

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn) 根據(jù)參考文獻(xiàn)，考察提取溶劑的種類、提取溶劑濃度、pH、料液比、提取時(shí)間、提取功率對(duì)原花青素提取效果的影響。

1.2.4.1 提取溶劑的選擇［11-12］準(zhǔn)確稱取1.0g 石榴籽干粉，選用pH4.5 的50%不同溶劑(丙酮、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙腈)，在料液比1 ∶30，超聲波功率150W 條件下浸提70min，離心，測定提取液吸光度，根據(jù)原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中原花青素含量，從而換算出原花青素得率，以得率為考察指標(biāo)，確定較佳的提取溶劑。重復(fù)3 次，取平均值。

1.2.4.2 提取溶劑濃度的確定 準(zhǔn)確稱取1.0g 石榴籽干粉，其他條件保持不變，考察不同乙醇溶液濃度對(duì)原花青素得率的影響，重復(fù)3 次，取平均值。

1.2.4.3 pH 的確定 準(zhǔn)確稱取1.0g 石榴籽干粉，選用50%乙醇溶液進(jìn)行提取，其他條件保持不變，考察不同pH 對(duì)原花青素得率的影響，重復(fù)3 次，取平均值。

1.2.4.4 料液比的確定 準(zhǔn)確稱取1.0g 石榴籽干粉，選用50%乙醇溶液在pH5.0 條件下進(jìn)行提取，其他條件保持不變，考察不同料液比對(duì)原花青素得率的影響，重復(fù)3 次，取平均值。

1.2.4.5 提取時(shí)間的確定 準(zhǔn)確稱取1.0g 石榴籽干粉，選用50%乙醇溶液在pH5.0，料液比1∶30 條件下進(jìn)行提取，其他條件保持不變，考察不同提取時(shí)間對(duì)原花青素得率的影響，重復(fù)3 次，取平均值。

1.2.4.6 提取功率的確定 準(zhǔn)確稱取1.0g 石榴籽干粉，選用50%乙醇溶液在pH5.0，料液比1∶30 條件下提取70min，考察不同提取功率對(duì)原花青素得率的影響，重復(fù)3 次，取平均值。

1.2.5 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)［13］響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平見表1。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表Table 1 Factors and the level of response surface analysis

2 結(jié)果與分析

2.1 原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線

以原花青素濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，得回歸方程:y = 3.55x + 0.0011，R2= 0.9995。結(jié)果表明，測定在0～0.2mg/mL 范圍內(nèi)線性良好。

圖1 原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of proanthocyanidins

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 提取溶劑的選擇 原花青素含有羥基，易發(fā)生氫鍵締合作用，因此要求提取溶劑不僅對(duì)其具有良好的溶解性，而且具有氫鍵斷裂作用［6］。由圖2 可知，丙酮提取效果最好，但溶劑殘留不易除盡，對(duì)人體有一定毒害，不適合在食品、藥品和化妝品中使用。而乙醇來源豐富，價(jià)格低廉，能有效提取原花青素且提取液易于保存、回收，安全性也較高，因此選用乙醇作為提取溶劑。

圖2 不同溶劑對(duì)原花青素提取效果的影響Fig.2 The impact of proanthocyanidins extracted effect with different solvents

2.2.2 提取溶劑濃度的確定 由圖3 可知，原花青素得率隨乙醇濃度變化先升后降?？赡苡捎谠ㄇ嗨卦谥参矬w內(nèi)常與蛋白質(zhì)、多糖以氫鍵和疏水鍵的形式形成穩(wěn)定的復(fù)合物，水可以提高原花青素的溶解度，而有機(jī)溶劑能促進(jìn)氫鍵斷裂，使其變成小分子物質(zhì)，易于游離到胞外，從而萃取到溶劑中［6］。隨著乙醇濃度的增加，水溶解帶出的原花青素濃度逐漸達(dá)到飽和。當(dāng)水溶解帶出的分子與乙醇斷開氫鍵形成的分子數(shù)達(dá)到平衡時(shí)得率最高。繼續(xù)增大乙醇濃度，一些醇溶性雜質(zhì)和親脂性強(qiáng)的成分溶出增加，與原花青素競爭同乙醇-水分子結(jié)合，導(dǎo)致提取得率下降［14］。提取液體積分?jǐn)?shù)的增大使原花青素氧化速率加快也是得率下降的原因之一。故而選擇濃度為50%的乙醇溶液進(jìn)行提取。

圖3 乙醇濃度對(duì)原花青素得率的影響Fig.3 The impact of procyanidins yield with different ethanol concentration

2.2.3 pH 的確定 從圖4 可知，加入少量酸可以打開以氫鍵和疏水鍵與蛋白質(zhì)、多糖以及本身相連的原花青素和以共價(jià)鍵與植物組織分子相連的多酚，形成更多的游離多酚和原花青素，酸還可以抑制酚類物質(zhì)與金屬離子發(fā)生的沉淀反應(yīng)，從而提高多酚的得率。但是pH 過小，多酚的溶解性能反而減小，降低得率，可能由于原花青素含有多個(gè)羥基，一般呈弱酸性，易溶于堿性溶液中，酸度過低降低其溶解性。pH 過高，可能發(fā)生酸堿中和反應(yīng)破壞原花青素的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致得率下降。故選擇pH 為5.0。

圖4 pH 對(duì)原花青素得率的影響Fig.4 The impact of procyanidins yield with different pH

2.2.4 料液比的確定 根據(jù)圖5 可以看出，當(dāng)料液比小于1∶30 后，隨溶劑用量增大，得率開始下降。因?yàn)榱弦罕冗_(dá)一定程度時(shí)，有效成分基本完全析出，此時(shí)繼續(xù)增大料液比，會(huì)使更多雜質(zhì)溶出，而且增加了生產(chǎn)成本［15］。因此選擇料液比為1∶30。

2.2.5 提取時(shí)間的確定 由圖6 可知，在一定時(shí)間范圍內(nèi)，原花青素的得率隨著提取時(shí)間的延長而增加，原因是原花青素沒有完全提出。70min 得率達(dá)到最大。70min 以后，大部分原花青素被浸提出來，原花青素的氧化處于主導(dǎo)地位，發(fā)生自身氧化還原反應(yīng)，而且原花青素遭到超聲波破壞，得率下降［16-17］。故選擇提取時(shí)間為70min。

圖5 料液比對(duì)原花青素得率的影響Fig.5 The impact of procyanidins yield with different solid-liquid ratio

圖6 提取時(shí)間對(duì)原花青素得率的影響Fig.6 The impact of procyanidins yield with different extraction time

2.2.6 提取功率的確定 根據(jù)圖7 可知，在一定功率下，超聲波產(chǎn)生的強(qiáng)烈振動(dòng)、高加速度、強(qiáng)烈的空化效應(yīng)和攪拌等特殊作用，可以使植物的細(xì)胞壁破壞，溶劑滲透到細(xì)胞，令原花青素溶于其中，從而提高提取效率。功率過大，細(xì)胞中其他物質(zhì)溶出率也提高，這些物質(zhì)與原花青素競爭同乙醇-水分子結(jié)合，而且，高功率的超聲波放出大量的熱，破壞原花青素的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致原花青素得率下降［18］。因此選擇125W作為提取功率。

圖7 提取功率對(duì)原花青素得率的影響Fig.7 The impact of procyanidins yield with different extraction power

2.3 響應(yīng)面分析法優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.3.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 采用Design-Expert V8.0.6 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，可以求出影響各因素一次效應(yīng)、二次效應(yīng)及其交互效應(yīng)的關(guān)聯(lián)方程，對(duì)超聲波輔助提取石榴籽原花青素的影響因素進(jìn)行條件優(yōu)化，并作出響應(yīng)面圖。多元回歸擬合分析得到的得率與各因素變量間的二次方程模型為:

表2 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Experimental design for response surface analysis and corresponding experimental data

根據(jù)表3 可知，用上述回歸方程描述各因素與響應(yīng)值間的關(guān)系時(shí)，因變量與各自變量間的線性關(guān)系顯著，模型的顯著水平小于0.05，回歸方程模型極顯著，且方程失擬項(xiàng)不顯著，表明該方程對(duì)實(shí)驗(yàn)的擬合情況好。模型的校正決定系數(shù)為0.9904，說明該模型能解釋99.04%響應(yīng)值的變化，僅有約0.96%不能用該模型解釋。信噪比為43.573，遠(yuǎn)大于4，說明可信度很高。相關(guān)系數(shù)為0.9952，說明該模型擬合程度良好，預(yù)測值和真實(shí)值之間有較好的相關(guān)性，實(shí)驗(yàn)誤差小，因此可用此回歸方程對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析預(yù)測［19-20］。由F 值可以得到各因素對(duì)得率影響從大到小的順序依次為:料液比(X3)、pH(X2)、乙醇濃度(X4)、功率(X1)。

圖8～圖12 是從實(shí)驗(yàn)得到的回歸優(yōu)化響應(yīng)面圖，從圖中可看出各因素在提取過程中的交互作用，由于X1X3交互作用不顯著，故不再列出。響應(yīng)面圖的曲面越陡，交互作用越顯著，反之越不顯著。等高線的形狀也可反映交互效應(yīng)的強(qiáng)弱，橢圓形表示交互作用顯著，圓形則與之相反［21］。比較圖8～圖12 可知，料液比(X3)曲線相對(duì)較陡，因此對(duì)原花青素得率的影響最顯著;而功率(X1)曲線較為平滑，響應(yīng)值變化隨其數(shù)值的變化較小，因此對(duì)原花青素得率影響較小。pH(X2)和料液比(X3)的交互作用最顯著，表現(xiàn)為等高線形狀為橢圓形。

圖8 功率、pH 及其相互作用對(duì)原花青素得率影響的響應(yīng)面Fig.8 Response surface showing the effects of power and pH on extraction yield of PC

圖9 功率、濃度及其相互作用對(duì)原花青素得率影響的響應(yīng)面Fig.9 Response surface showing the effects of power and concentration on extraction yield of PC

圖10 pH、料液比及其相互作用對(duì)原花青素得率影響的響應(yīng)面Fig.10 Response surface showing the effects of pH and solid-liquid ratio on extraction yield of PC

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

圖11 pH、濃度及其相互作用對(duì)原花青素得率影響的響應(yīng)面Fig.11 Response surface showing the effects of pH and concentration on extraction yield of PC

圖12 料液比、濃度及其相互作用對(duì)原花青素得率影響的響應(yīng)面Fig.12 Response surface showing the effects of solid-liquid ratio and concentration on extraction yield of PC

2.3.2 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 根據(jù)模型可預(yù)測提取的最優(yōu)工藝條件為:功率124.06W，pH4.89，料液比1∶33.38，濃度50.88%，在此條件下，原花青素得率理論值可達(dá)4.41%。

為檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果是否與真實(shí)情況一致，進(jìn)行近似驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)?？紤]實(shí)際操作條件，將最佳工藝條件定為:功率125W，pH5.0，料液比1∶33，濃度51%，進(jìn)行3 次平行實(shí)驗(yàn)，原花青素得率為4.40%，與理論值相比，相對(duì)誤差約為0.23%，且重復(fù)性較好，證明結(jié)果可靠。

3 結(jié)論

采用超聲輔助提取石榴籽中原花青素，通過單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，得到較優(yōu)工藝條件為:功率125W，pH5.0，料液比1∶33，濃度51%，在此條件下，石榴籽原花青素得率為4.40%。

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