響應(yīng)面法優(yōu)化獼猴桃原酒發(fā)酵工藝

霍丹群，王洪彬，宋興興，劉 淼，何 誠，周 軍，侯長軍

(1.重慶大學(xué)生物工程學(xué)院，重慶400044;2.國家固態(tài)釀造工程技術(shù)研究中心，瀘州老窖股份有限公司，四川瀘州646000)

獼猴桃又名陽桃，果實(shí)皮薄多汁，酸甜可口，含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，如維生素、有機(jī)酸、糖分及Ca、Fe、K 等［1］，素有“水果之王”的美譽(yù)［2］。研究發(fā)現(xiàn)，獼猴桃具有預(yù)防老年骨質(zhì)疏松，改善心肌功能，防治心臟病等功效。中國是獼猴桃的故鄉(xiāng)［3］，栽培面積和產(chǎn)量分居世界第一和第四，由于獼猴桃不易貯存，成熟季節(jié)獼猴桃市場供大于求，除鮮食外，主要用于加工附加值較低的果汁、果脯、果醬等產(chǎn)品［4-6］，因此開發(fā)獼猴桃新產(chǎn)品，推動獼猴桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展勢在必行。用獼猴桃生產(chǎn)果酒，其獨(dú)特的保健作用和高附加值，不僅會受到消費(fèi)者和生產(chǎn)者的喜愛，且順應(yīng)酒類產(chǎn)業(yè)政策轉(zhuǎn)變(糧食酒向果酒轉(zhuǎn)變，高度酒向低度酒轉(zhuǎn)變，低檔酒向高檔酒轉(zhuǎn)變)［7］，具有廣闊的發(fā)展前景。研究者們對獼猴桃果酒的發(fā)酵溫度、二氧化硫添加量、裝瓶量、接種量、原酒的后處理等工藝條件進(jìn)行了研究［8-10］，較多的沿用傳統(tǒng)的殘?zhí)?、總酸等作為理化指?biāo)，對于釀造工藝參數(shù)與獼猴桃酒香味物質(zhì)含量(g/L)之間的關(guān)系研究較少。因此，本實(shí)驗(yàn)通過Box- Behnken 響應(yīng)面法，采用獼猴桃酒酒精度(20℃)［11］及主要香味物質(zhì)含量(g/L)作為雙重響應(yīng)值，得到二者與工藝參數(shù)之間的最優(yōu)條件，為實(shí)現(xiàn)獼猴桃酒的工業(yè)化生產(chǎn)及其新產(chǎn)品的開發(fā)提供了基礎(chǔ)研究資料。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實(shí)驗(yàn)獼猴桃 四川長清;葡萄糖、碳酸鈣 重慶博藝化學(xué)試劑有限公司;檸檬酸、亞硫酸 重慶川東化工(集團(tuán))有限公司;安琪葡萄酒用高活性干酵母湖北安琪酵母股份有限公司。

2010 型質(zhì)譜儀GC-MS 島津;DB-Wax 型色譜柱(30m ×0.25mm ×0.25μm) 安捷倫;恒溫恒濕培養(yǎng)箱 上海森信;精密電子天平 梅特勒—托利多;糖度計(jì) 天津鏡象儀器;酒精度計(jì) 河北武強(qiáng)儀表;PHS-3C 型精密酸度計(jì) 上海雷茲。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 獼猴桃原酒發(fā)酵工藝流程 獼猴桃鮮果→分選→清洗→破碎榨汁→調(diào)整果汁糖度→添加亞硫酸→調(diào)節(jié)pH→接種→前發(fā)酵→倒罐→去除酒腳→后發(fā)酵→降酸→陳釀→過濾→獼猴桃發(fā)酵原酒

1.2.2 發(fā)酵條件 初始糖度調(diào)整:根據(jù)需要的酒精度，以1.70g/L 糖產(chǎn)1°酒精計(jì)算所需要添加的葡萄糖量［12］;亞硫酸的添加:以60mg/L 的SO2量添加［13］;pH 的調(diào)整:添加檸檬酸或者碳酸鈣［14］;酵母活化:在獼猴桃果汁中按0.05g/mL 的量添加干酵母，攪拌溶解，38℃復(fù)水活化30min，冷卻至30℃即可使用;前發(fā)酵:將調(diào)整好的獼猴桃果漿以70%的裝瓶量在25℃下發(fā)酵，至發(fā)酵繆殘?zhí)恰?g/L［15］。降酸、陳釀:用酒石酸鉀降酸至6.5g/L(檸檬酸計(jì))，陳釀30d。

1.2.3 發(fā)酵工藝最優(yōu)參數(shù)的確定 在單因素實(shí)驗(yàn)時，固定其中兩種因素不變，依次改變初始接種量、初始pH 和接種量;以酒精度(20℃)和主要香味物質(zhì)含量為評價指標(biāo)進(jìn)行研究和分析，并確定三因素三水平的最佳參數(shù)進(jìn)行響應(yīng)面分析［16-21］，共17 個實(shí)驗(yàn)點(diǎn)，5 個中心點(diǎn)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，其中各因素及水平編碼見表1。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平編碼表Table 1 Factors and levels of response surface experiments

1.2.4 獼猴桃原酒香氣分析 異丁醇、3-甲基丁醇、甲醇、丁酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯、乙酸、己酸、辛酸等是果酒中含量較高的微量物質(zhì)［22］，這對其風(fēng)味物質(zhì)特征的形成具有重要的作用，因此主要選擇以上幾種含量較高的微量物質(zhì)最為總醇、總酯和總酸的代表物質(zhì)作為香氣成分分析的研究對象。

GC-MS 分析條件:色譜條件:以N2作為載氣，柱流速為0.5mL/min;分流比為50∶1，尾吹約30～40mL/min;氫氣流速為30mL/min;空氣流速為300mL/min;檢測器溫度220℃;進(jìn)樣口溫度220℃，程序升溫條件為初始柱溫40℃、保持4min，以4℃/min 的速度上升至200℃，保持10min。質(zhì)譜條件:EI 電力源，電子能量為70eV，離子源溫度為200℃，接口溫度為250℃，掃描范圍為30～50amu。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 初始糖度對獼猴桃酒發(fā)酵的影響 固定接種量為0.25%，pH3.31 不變，設(shè)置不同的初始糖度，研究其對獼猴桃酒發(fā)酵的影響，結(jié)果見圖1、圖2。酒精度與香味物質(zhì)含量隨著初始糖度升高而增大。從圖1 可知，隨著初始糖度的升高，酒精度成增加趨勢，在初始糖度為25%之后基本上趨于穩(wěn)定;從圖2 可知，隨著初始糖度的增加，總醇含量逐漸升高，并在初始糖度為25%達(dá)到最大;總酯和總酸含量變化不大;總香味物質(zhì)含量逐漸升高勢，在初始糖度為25%達(dá)到最大。綜合考慮兩種評價指標(biāo)的最佳初始糖度，選取初始糖度22%、25%、28%做獼猴桃發(fā)酵酒的響應(yīng)面分析以確定最佳的初始糖度。

圖1 初始糖度對酒精度影響Fig.1 Influence of initial sugar content on alcohol content

圖2 初始糖度對主要香味物質(zhì)的影響Fig.2 Influence of initial sugar content on main aroma components content

2.1.2 初始pH 對獼猴桃酒發(fā)酵的影響 固定接種量為0.25%，初始糖度為25%，設(shè)置不同初始pH，研究其對獼猴桃酒發(fā)酵的影響，結(jié)果見圖3、圖4。從圖3 可知，隨著pH 的升高酒精度逐漸增大，并在初始pH 為3.50 時酒精度達(dá)到最大;從圖4 可知，隨著初始pH 的升高，主要香味物質(zhì)含量基本成先增加后降低的趨勢，在初始pH3.50～4.50 之間，總醇和總酯的含量趨于穩(wěn)定，總酸與總香味物質(zhì)含量逐漸升高，而甲醇含量在pH4.00 之后快速增長，而甲醇含量過高容易對身體健康造成損害，因此應(yīng)控制在較低的范圍內(nèi)。綜合考慮兩種評價指標(biāo)的最佳初始pH，選取初始pH3.30、3.60、3.90 作獼猴桃發(fā)酵酒的響應(yīng)面分析以確定最佳的初始pH。

圖3 初始pH 對酒精度影響Fig.3 Influence of initial pH on alcohol content

圖4 初始pH 對主要香味物質(zhì)的影響Fig.4 Influence of initial pH on main aroma components content

2.1.3 接種量對獼猴桃酒發(fā)酵的影響 固定初始糖度為25%，pH3.31 時，設(shè)置不同接種量，研究其對獼猴桃酒發(fā)酵的影響，結(jié)果見圖5、圖6。如圖5 所示，隨著接種量的增大，酒精度逐漸升高，并在接種量0.55%時達(dá)到最大，而后逐漸下降，其原因可能是較高濃度的酵母菌完成自身繁殖需要消耗大量的糖類物質(zhì)，致使發(fā)酵液中轉(zhuǎn)化為酒精的糖度降低，從而使酒精度偏低;從圖6 可知，隨著接種量的增大，主要香味物質(zhì)含量基本成先增加后降低趨勢，其中接種量0.35%～0.55%時，總香味物質(zhì)含量相對較高。綜合考慮兩種評價指標(biāo)的最佳接種量，選取接種量0.30%、0.45%、0.60%做獼猴桃發(fā)酵酒的響應(yīng)面分析以確定最佳的接種量。

圖5 接種量對酒精度的影響Fig.5 Influence of inoculation amount on alcohol content

2.2 響應(yīng)面法提取條件的優(yōu)化

2.2.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 對獼猴桃酒發(fā)酵工藝進(jìn)行響應(yīng)面分析，其具體實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果見表2。

利用Design-Expert8.0 統(tǒng)計(jì)軟件對該實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合，分別獲得酒精度(WA)與總香味物質(zhì)含量(WB)對自變量初始糖度(X)、初始pH(Y)、接種量(Z)的多元回歸方程:

圖6 接種量對主要香味物質(zhì)的影響Fig.6 Influence of inoculation amount on main aroma components content

表2 獼猴桃酒發(fā)酵工藝優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Optimization of fermentation conditions design and results of experimental design

由表3、表4 可知，方程(1)中除XY 與YZ 項(xiàng)無顯著影響外，其他項(xiàng)對酒精度的影響達(dá)到顯著水平(p ＜0.05)，其中一次項(xiàng)X、Y，交互項(xiàng)XZ 與二次項(xiàng)X、Y、Z 對酒精度的影響達(dá)到極顯著(p ＜0.01);方程(2)中除X 項(xiàng)和YZ 項(xiàng)無顯著影響外，其他項(xiàng)對總香味物質(zhì)含量的影響達(dá)到顯著水平(p ＜0.05)，其中一次項(xiàng)Y、Z，交互項(xiàng)XZ 與二次項(xiàng)X、Y、Z 對總香味物質(zhì)含量的影響達(dá)到非常顯著(p ＜0.01)。另外，通過F 值的大小，可以推斷在選定的實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)各因素對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重要性，F(xiàn) 值越大，其重要性越大，從表3中可知，各因素對酒精度的影響大小順序是:初始糖度＞初始pH ＞接種量;從表4 中可知，各因素對主要香味物質(zhì)的影響大小順序是:初始pH ＞接種量＞初始糖度。

表3 方差分析結(jié)果(酒精度為響應(yīng)值)Table3 ANOVE of regression analysis(alcoholic content as response value)

表4 方差分析結(jié)果(主要香味物質(zhì)含量為響應(yīng)值)Table4 ANOVE of regression analysis(the main aroma components content as response value)

2.2.2 各因素之間的交互作用 為探究3 個因素兩兩之間的交互作用對獼猴桃原酒發(fā)酵的影響，對其響應(yīng)面曲線及等高線圖進(jìn)行分析，從圖中可以直觀看出優(yōu)化區(qū)域，從而得到較高的酒精度和總香味物質(zhì)含量。如圖8～圖13 所示，橢圓形等高線圖表示兩兩之間的交互作用比較顯著。其中圖8～圖10 表明初始糖度對獼猴桃原酒發(fā)酵酒精度的影響非常顯著而初始pH 和接種量對獼猴桃酒精度的影響顯著性不大，偏高或偏低的初始糖度都會使獼猴桃發(fā)酵酒精度降低。圖11～圖13 初始糖度對獼猴桃原酒發(fā)酵總香味物質(zhì)含量的影響顯著性不大而初始pH 和接種量對獼猴桃總香味物質(zhì)含量的影響非常顯著。

圖8 初始糖度和初始pH 對酒精度影響的曲面圖Fig.8 Response surface of initial sugar and pH on alcohol content

圖9 初始糖度和接種量對酒精度影響的曲面圖Fig.9 Response surface of initial sugar and inoculation amount on alcohol content

圖10 初始pH 和接種量對酒精度影響的曲面圖Fig.10 Response surface of initial pH and inoculation amount on alcohol content

圖11 初始糖度和初始pH 對總香味物質(zhì)含量影響的曲面圖Fig.11 Response surface of initial sugar and pH on total aroma components content

圖12 初始糖度和接種量對總香味物質(zhì)含量影響的曲面圖Fig.12 Response surface of initial sugar and inoculation amount on total aroma components content

圖13 初始pH 和接種量對總香味物質(zhì)含量影響的曲面圖Fig.13 Response surface of initial pH and inoculation mount on total aroma components content

2.3 獼猴桃原酒發(fā)酵工藝條件驗(yàn)證

通過Design-Expert8.0 統(tǒng)計(jì)軟件聯(lián)合求解模型方程(1)和(2)，得出獼猴桃原酒發(fā)酵的最優(yōu)參數(shù)條件:初始糖度25%，初始pH3.65，接種量0.47%。為檢驗(yàn)響應(yīng)面法所得到的結(jié)果的可靠性采用上述優(yōu)化優(yōu)參數(shù)進(jìn)行獼猴桃原酒發(fā)酵，考慮到實(shí)際操作的便利，將獼猴桃原酒發(fā)酵工藝參數(shù)優(yōu)化為初始糖度25%，初始pH3.6，接種量0.47%。根據(jù)此最優(yōu)參數(shù)進(jìn)行獼猴桃原酒發(fā)酵(n =3)以驗(yàn)證響應(yīng)面法的可行性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，平均酒精度和總香味物質(zhì)含量分別為12.75° 和1.42386g/L，與預(yù) 測值12.80° 和1.45131g/L 相差很小，表明該模型可以較好地反映出獼猴桃原酒發(fā)酵工藝條件，從而也證明了Box-Behnken 響應(yīng)面法(RSM)優(yōu)化獼猴桃原酒發(fā)酵工藝的可行性。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken 響應(yīng)面法(RSM)對獼猴桃原酒發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到二次多項(xiàng)式回歸模型，探討各因素間的交互作用，并對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行數(shù)學(xué)模擬和預(yù)測。最終確定了獼猴桃原酒發(fā)酵的最優(yōu)參數(shù):初始糖度0.25%，初始pH3.6，接種量0.47%，并且根據(jù)此條件得到的平均酒精度和總香味物質(zhì)含量分別為12.75°和1.42386g/L。綜合回歸模型分析和驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，采用響應(yīng)面優(yōu)化的獼猴桃原酒發(fā)酵參數(shù)具有一定的實(shí)際應(yīng)用價值。

［1］王燕.野生獼猴桃原酒發(fā)酵原料篩選與最佳配比研究［J］.釀酒科技，2011(10):32-34.

［2］王勵治，蔣和體.野生獼猴桃干酒釀造工藝［J］.食品科學(xué)，2010(24):484-487.

［3］甘莆兵，鄭永政，帥桂蘭，等.獼猴桃酒的生產(chǎn)［J］.釀酒，2007(2):64-66.

［4］李加興，孫金玉，陳雙平，等.獼猴桃果醋發(fā)酵工藝優(yōu)化及質(zhì)量分析［J］.食品科學(xué)，2011(24):306-310.

［5］李加興，袁秋紅，陳建伏，等.獼猴桃果粒果汁飲料生產(chǎn)工藝及其穩(wěn)定性研究［J］.食品科技，2007(4):148-151.

［6］陳景，黃群，吳竹青，等.獼猴桃果醋運(yùn)動保健飲料的研制［J］.食品科學(xué)，2008(9):708-711.

［7］陳云宗，周瑞平，唐代云，等.獼猴桃原酒發(fā)酵工藝參數(shù)初步研究［J］.釀酒科技，2009(10):78-79.

［8］彭幫柱，岳田利，袁亞宏，等.獼猴桃酒釀造工藝參數(shù)優(yōu)化及其香氣成分分析［J］.農(nóng)業(yè)工程學(xué)報，2007(2):229-232.

［9］羅曉妙，陳安均.獼猴桃酒的釀造與質(zhì)量控制［J］.釀酒科技，2004(4):75-77.

［10］賀小賢，孫宏民.液體發(fā)酵獼猴桃酒的研究［J］.釀酒科技，2003(5):88-89.

［11］Jang SY，Woo SM，Kim OM，et al. Optimum alcohol fermenting conditions for kiwi (Actinidia chinensis)wine spectroscopy［J］.Food Science and Biotechnology，2007，16(4):526-530.

［12］周桃英.獼猴桃果酒釀造工藝研究［J］.江蘇食品與發(fā)酵，2008(1):26-30.

［13］趙中勝，韋娜，富維納，等.獼猴桃酒發(fā)酵工藝研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012(6):3548-3550.

［14］張明霞，張秀梅.固定化獼猴桃酒酵母發(fā)酵條件的研究［J］.釀酒科技，2004(3):68-70.

［15］李加興，姚茂君，張永康，等.獼猴桃酒生產(chǎn)工藝研究［J］.吉首大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，1999(3):78-81.

［16］李偉橋，沐萬孟，江波，等.響應(yīng)面優(yōu)化γ-谷氨酰甲胺酶法合成條件的研究［J］.食品工業(yè)科技，2011，32(1):215-218.

［17］劉小藝，闞建全，阮志勇，等.應(yīng)用響應(yīng)面優(yōu)化泡菜用微生物的富集培養(yǎng)基［J］.食品工業(yè)科技，2011，32(5):183-189.

［18］張仁楠，姚磊，富校軼.響應(yīng)面法優(yōu)化植酸酶水解大豆分離蛋白的工藝［J］.食品工業(yè)科技，2011，32(11):292-295.

［19］謝捷，曹銘希，朱興一，等.響應(yīng)面法優(yōu)化閃式提取陳皮中橙皮苷工藝的研究［J］.食品工業(yè)科技，2010，31(10):285-288.

［20］Sahin Selin，Samli Ruya.Optimization of olive leaf extract obtained by ultrasound-assisted extraction with response surface methodology［J］. Ultrasonics Sonochemistry，2013，20 (1):595-602.

［21］Fan J P，Cao J，Zhang XH，et al.Optimization of ionic liquid based ultrasonic assisted extraction of puerarin from Radix Puerariae Lobatae by response surface methodology［J］.Food Chemistry，2012，135(4):2299-2306.

［22］梁新紅，趙功玲.獼猴桃干酒香氣成分的GC/MS 分析［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006(19):5022-5023.