脂肪氧化酶對啤酒抗氧化性能的影響及其特性研究

李 紅，方貴權(quán)，李惠萍，李 琳，何 熙，張五九

(1.廣州珠江啤酒股份有限公司技術(shù)中心，廣東廣州510308;2.華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東廣州510640;3.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京100027)

啤酒的風(fēng)味穩(wěn)定性不僅僅與成品啤酒的氧化有關(guān)，啤酒生產(chǎn)過程中的氧化反應(yīng)也會對成品啤酒的風(fēng)味穩(wěn)定性產(chǎn)生重要的影響，因此控制啤酒生產(chǎn)過程中的氧化反應(yīng)對提高啤酒抗氧化性能具有重要的意義。麥芽等啤酒釀造原料中含有較高的脂類物質(zhì)(見表1)［1］，因此脂肪酸的氧化長期以來都被認(rèn)為是成品啤酒風(fēng)味在儲藏過程中發(fā)生劣化的重要途徑之一［2］。啤酒釀造過程中的脂肪酸的氧化可以在酶催化的作用下發(fā)生，也可以在非酶催化的作用下發(fā)生，其中脂肪酸在酶催化下的反應(yīng)稱作脂肪酸的酶促氧化，而非酶催化下的反應(yīng)稱作脂肪酸的自動氧化［3］。要控制脂肪酸的氧化對啤酒的風(fēng)味穩(wěn)定性產(chǎn)生危害，一方面要控制原料中脂肪及脂肪酸的含量，另一方面要盡量減少脂肪酸的氧化反應(yīng)。脂肪氧化酶廣泛存在于植物當(dāng)中［4-5］，啤酒大麥中也不例外［6］，成品麥芽中也含有較高的脂肪氧化酶活性。控制釀造過程中脂肪氧化酶的活性被認(rèn)為是控制脂肪酸氧化提高啤酒風(fēng)味穩(wěn)定的重要措施之一［7-9］，也是啤酒風(fēng)味穩(wěn)定性領(lǐng)域內(nèi)的熱點課題之一。

表1 大麥和麥芽的脂類的含量和組成(%)Table 1 Lipids in barley and malt(%)

脂肪氧化酶(英文為lipoxidase)能催化含有順，順-1，4-戊二烯殘基的脂肪酸(如亞油酸和亞麻酸等)與氧氣發(fā)生加合反應(yīng)形成氫過氧化脂肪酸，因此脂肪氧化酶也稱為脂肪氧合酶(英文為lipoxygenase，簡寫為LOX)。啤酒麥芽中的脂肪氧化酶有兩種同功酶分別為LOX-1 和LOX-2［10-11］，這兩種酶的催化產(chǎn)物不同，例如當(dāng)?shù)孜锸莵営退釙r，在LOX-1 的催化下形成9-LOOH，而在LOX-2 的催化下形成13-LOOH［1，12］。一般認(rèn)為原大麥中只存在LOX-1，在制麥過程LOX-1 會增加，LOX-2 也會產(chǎn)生［6］，但是經(jīng)過焙焦之后的成品麥芽中也主要含有LOX-1 的酶活［2］。國外對脂肪氧化酶的研究起步較早，據(jù)報道丹麥嘉士伯的研究人員已培育出LOX 缺失的大麥，也有研究者選育出低LOX-1 的大麥并申請專利［13］。而國內(nèi)對脂肪氧化酶的研究還基本處于空白，企業(yè)也沒有采取相應(yīng)的控制措施。本研究的主要目的是考察脂肪氧化酶對啤酒風(fēng)味穩(wěn)定性的影響，闡明其酶學(xué)性質(zhì)并確定其釀造過程中的變化規(guī)律，為更好地控制脂肪酸的氧化，提高啤酒的抗氧化性能提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

麥芽、大米、酵母 均為國內(nèi)某企業(yè)提供;脂肪氧化酶 生物試劑(460U/mg)，Sigma;TBA 純度≥99%，Merck;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

DLFU- W23050 型麥芽粉碎機(jī) 德國Buhler universal;V3140 型分光光度計 澳大利亞GBC公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗室麥汁制備(模擬大生產(chǎn)工藝)

1.2.1.1 原料配比 麥芽48g(實驗采用同一批麥芽)，大米30g。

1.2.1.2 糊化 全部大米及1g 麥芽加50℃水90mL，添加耐高溫α-淀粉酶0.1mL。糊化溫度進(jìn)程為70℃(5min)→90℃(30min)→100℃(5min)→與蛋白休止結(jié)束的糖化醪混合。

1.2.1.3 糖化 麥芽47g，加45℃水180mL。糖化溫度進(jìn)程為45℃(40min)→63℃(30min)→73℃(30min)→78℃(過濾)。過濾后加78℃水，定重至457g，在燒杯中煮沸30min。

1.2.2 300mL 發(fā)酵實驗 取生產(chǎn)酵母泥適量接入300mL 麥汁中，12℃恒溫發(fā)酵(帶發(fā)酵栓)至發(fā)酵8d。

1.3 分析方法

1.3.1 麥汁或發(fā)酵液氧化程度的評價——TBA 值原理:樣品氧化后產(chǎn)生的羰基化合物與TBA 反應(yīng)生成的化合物在530nm 有吸收峰，在此波長下采用1cm 比色皿測定其吸光值，該吸光值稱為TBA 值，可據(jù)TBA 值的高低比較樣品的氧化程度［14-17］。

基本步驟:取10mL 啤酒在10000r/min 高速下離心到澄清。取上清液5mL，加入2mL 質(zhì)量濃度為3.3g/L 的TBA 溶液(溶劑是體積分?jǐn)?shù)為50%乙酸溶液)，并混合均勻，在60℃水浴中精確加熱60min，然后迅速冷卻，于530nm 下比色，同時以水為空白，并用空白調(diào)零。

結(jié)果計算:用吸光值表示TBA 值，TBA 值越大表示氧化程度越嚴(yán)重。

1.3.2 脂肪氧化酶酶活的測定 采用亞油酸氧化法。酶活單位定義為:在室溫和pH6.5 的條件下，以每分鐘234nm 下吸光值增加1 的酶量為1 個活力單位。比酶活力:每g(固體樣品)或每mL(液體樣品)樣品中所含的酶活單位。主要操作要點如下:

1.3.2.1 麥芽和大麥中酶的提取 取2.0g 麥芽粉碎(EBC 磨細(xì)粉)后，加入pH4.0 的0.1mol/L 磷酸緩沖液溶液20mL，震蕩30min(室溫下，150r/m)后，5000r/min 離心10min，上清液再過濾，低溫儲藏備用。

1.3.2.2 脂肪氧化酶的測定 在比色皿中加入3mL 0.1mol/L pH6.5 的磷酸緩沖液和0.2mL 5mmol/L 的亞油酸溶液，于234nm 下進(jìn)行調(diào)零，迅速加入50μL酶液，同時開始計時，并進(jìn)行吸光值掃描。

1.3.2.3 酶活的計算

脂肪氧化酶活力(U/g)=ΔOD234nm×V2/Δt ×V1×D ×V0/W

Δt-反應(yīng)時間(min);V1-參與反應(yīng)的酶液體積(mL)，這里為0.05mL;V2-反應(yīng)體系總體積(mL)，這里為3.25mL;V0-提取液的體積(mL)，這里為20mL;D-提取液的稀釋倍數(shù);W-樣品的重量，這里為2g。

2 結(jié)果與討論

2.1 麥芽中LOX 的活力

測定了51 個國內(nèi)主要麥芽廠(包括廣州麥芽廠、寧波麥芽廠、寶應(yīng)麥芽及珠江麥芽廠)生產(chǎn)的普通淡色啤酒麥芽樣品的LOX 的酶活，這些麥芽品種是目前國內(nèi)啤酒企業(yè)廣泛使用的品種。將檢測結(jié)果按大麥種植國別進(jìn)行簡單歸類，得到圖1 所示結(jié)果。從圖1 可以看出，普通淡色啤酒麥芽的LOX 的酶活在集中在7～20U/g 之間。每個國家種植的大麥制成麥芽之后，所得麥芽的LOX 的酶活均有較大的波動，這主要是因為每個國家種植的大麥品種本身就多樣化，而且這些麥芽來自多個不同的麥芽加工企業(yè)。

就平均水平來看，澳麥和法麥顯示出較低的LOX 酶活，而國產(chǎn)麥芽具有較高的LOX 酶活，而加麥的LOX 的酶活是進(jìn)口麥芽中最高的。進(jìn)行方差分析發(fā)現(xiàn)(表2)，大麥的種植國對麥芽的LOX 的酶活性有統(tǒng)計學(xué)上顯著影響。

另外還檢測了1 個黑麥芽的LOX 的酶活，其酶活僅為2.8U/g，這說明麥芽的焙焦強(qiáng)度對成品麥芽的LOX 的酶活力也有重要的影響。

圖1 麥芽中LOX 的酶活力Fig.1 LOX activity in malts

表2 不同國家麥芽LOX 的酶活方差分析結(jié)果Table 2 ANOVA of LOX activity in malts from different countries

2.2 LOX 對啤酒抗氧化性能的影響

為了弄清LOX 對啤酒抗氧化能力的影響，在實驗室模擬大生產(chǎn)工藝制備13°P 麥汁，在蛋白休止階段加入一定量的LOX，LOX 的添加量按每g 麥芽1U和5U 計，同時做不加LOX 的空白對照，并將所得麥汁在相同的條件下進(jìn)行發(fā)酵，麥汁及發(fā)酵液的相關(guān)抗氧化指標(biāo)見表3。

由表3 可看出，添加LOX 后麥汁的TBA 有較明顯的增加，當(dāng)LOX 的添加量為1U/g 時，麥汁的TBA增加8.2%，而當(dāng)LOX 的添加量為5U/g 時，麥汁的TBA 的增加幅度達(dá)到27%，這說明LOX 在糖化過程的確會引起脂肪酸的氧化，從而導(dǎo)致麥汁的氧化程度加大，抗氧化性能下降。

從表3 還可以看出，LOX 不但對麥汁的TBA 有影響，對發(fā)酵之后的發(fā)酵液的TBA 也有影響，當(dāng)LOX的添加量為1U/g 時，成熟發(fā)酵液的TBA 和空白相當(dāng)，但是對LOX 的添加量為5U/g 的實驗組來說，其發(fā)酵液的TBA 仍然最高，比對照組高12.2%。因此綜合而言，麥芽中的LOX 在糖化過程中會引起脂肪酸的氧化，從而導(dǎo)致麥汁和成品啤酒的老化程度增加抗氧化性能下降。

表3 糖化添加LOX 對抗氧化性能的影響Table 3 Effect of LOX added at the start of mashing on antioxidation ability of wort and beer

2.3 麥芽LOX 的主要酶學(xué)性質(zhì)

2.3.1 麥芽LOX 最適pH 為了確定麥芽LOX 的最適催化pH，以麥芽酶提取液作為研究對象，反應(yīng)溫度固定在25℃，在不同的pH 緩沖體系中進(jìn)行催化反應(yīng)，以酶活最高點作為基準(zhǔn)，算出其他pH 下的LOX酶活的相對大小，結(jié)果見圖2。從圖2 可以看出麥芽中的LOX 在pH4.5～8.5 之內(nèi)都有一定的酶活性，其中在pH6.5，酶活最高，為麥芽LOX 的最適pH。當(dāng)pH 小于4 或高于9 時，LOX 幾乎完全沒有催化活性。

在實際生產(chǎn)的時候，糖化醪液的pH 通常在5.0～5.5左右，該pH 雖然偏離其最適pH6.5，但是在此pH 下LOX 仍有較強(qiáng)的活力，從圖2 知在pH5.0 時，催化活性為最適pH 下的72%。

圖2 麥芽中LOX 催化活性與pH 的關(guān)系Fig.2 Effect of pH on LOX activity of malt

2.3.2 麥芽LOX 的最適溫度 為了確定麥芽中LOX的最適催化溫度，以麥芽酶提取液作為研究對象，反應(yīng)體系的pH 固定在6.5，在不同的溫度下進(jìn)行催化反應(yīng)，以酶活最高點作為基準(zhǔn)，算出其他溫度下的LOX 的相對活性，所得結(jié)果見圖3。從圖3 可以看出麥芽中的LOX 在不同溫度下的催化活性并沒呈現(xiàn)出典型的對稱的鐘罩形，而是在20℃到40℃之間表現(xiàn)出平穩(wěn)且較強(qiáng)的催化活性。

從圖3 還可以看出，當(dāng)反應(yīng)溫度小于20℃時，LOX 的催化活性急劇下降，例如15℃時酶催化活性僅殘留27.9%，而當(dāng)反應(yīng)溫度高于40℃時，LOX 的催化活性則平穩(wěn)下降，45、50、55、60℃時，其催化活性殘留率分別為58.7%、39.7%、20.1%、8.9%。因此在麥芽質(zhì)量較好的情況下，糖化時盡量選擇高溫(50℃以上)下料，這樣有利于降低LOX 的危害。

圖3 麥芽中LOX 催化活性與溫度的關(guān)系Fig.3 Effect of temperature on LOX activity of malt

2.3.3 麥芽LOX 的熱穩(wěn)定性 為了探明麥芽LOX的熱穩(wěn)定性，將麥芽的酶提取液分裝成5 份，分別在40、50、60、70、80℃下進(jìn)行保存，每隔一段時間測定LOX 酶活，并計算LOX 酶活殘留率，所得結(jié)果見圖4。從圖4 可以看出隨著溫度的升高，麥芽LOX 的失活速度加快，特別是當(dāng)溫度超過50℃時，失活速度明顯加快。在40℃下放置6h 其酶活降低31%，在50℃下放置6h 則降低82%，說明麥芽中的LOX 不耐高溫，容易失活。

圖4 LOX 的熱穩(wěn)定性Fig.4 Stability of LOX activity of malt

麥芽是大麥經(jīng)過浸麥、發(fā)芽、干燥及焙焦等過程加工而成的，因此掌握制麥過程中LOX 的酶活變化規(guī)律對控制成品麥芽中的LOX 具有重要的意義。對50t 規(guī)模的大生產(chǎn)制麥過程中主要階段的樣品取樣檢測其中的LOX 的酶活，所得結(jié)果見圖5。

從圖5 可以看出大麥在浸泡之后，LOX 酶活僅為原大麥的64%左右，明顯下降，很多研究者［6，18-19］也發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象，究其原因，普遍認(rèn)為是由于浸麥過程中氧氣供應(yīng)不足造成的。但在此之后的發(fā)芽過程中LOX 酶活一直保持較快的增長，直至發(fā)芽結(jié)束，發(fā)芽最后1d 的LOX 的酶活為原大麥的5 倍多。

發(fā)芽結(jié)束之后進(jìn)入干燥階段，此時LOX 的酶活開始下降。從圖5 可以看出，在前期的自由水揮發(fā)階段，LOX 酶活力下降緩慢，67℃結(jié)束時LOX 活力僅下降18%。干燥溫度繼續(xù)升至72℃時，進(jìn)入中間干燥階段，這時麥芽中的LOX 酶活下降幅度變快，當(dāng)75℃結(jié)束時LOX 活力僅剩下32%。焙焦之后LOX活力進(jìn)一步降低，甚至低于原大麥的LOX 活性。

2.4 制麥過程中LOX 的酶活變化特征

2.5 糖化過程中LOX 的酶活變化特征

糖化是麥芽中LOX 能夠發(fā)揮催化作用的重要過程，弄清糖化過程中LOX 酶活的變化情況具有重要意義。對工業(yè)化大生產(chǎn)規(guī)模的啤酒糖化過程中LOX酶活進(jìn)行跟蹤檢測，在檢測的時候發(fā)現(xiàn)一個奇怪的現(xiàn)象，就是煮沸之后的麥汁中仍然能檢測出輕微的LOX 酶活，為0.3U/mL 左右，這和LOX 不耐熱的結(jié)論相矛盾。經(jīng)查閱文獻(xiàn)并研究分析，認(rèn)為引起這種現(xiàn)象的原因是由LOX 酶活檢測方法引起的，因此在分析糖化過程中的LOX 酶活時，均扣除此輕微背景值，并以下料時的酶活為基準(zhǔn)，計算糖化各階段的LOX 酶活相對大小，所得結(jié)果見圖6。

圖5 啤酒大麥制麥過程中LOX 的酶活Fig.5 LOX activity of barley during malting process

從圖6 可以看出，麥芽醪液經(jīng)42℃蛋白休止后，LOX 酶活僅剩32%，當(dāng)醪液溫度升至63℃時，LOX幾乎全部失活，和前人的研究結(jié)果相似［20］。這些結(jié)果表明糖化過程中的麥芽下料、蛋白休止及升溫至糖休止等階段是LOX 氧化脂肪酸的重要過程。因此提高糖化下料溫度并縮短糖化下料時間，提高蛋白休止溫度有利于控制LOX 的催化氧化作用。

圖6 大生產(chǎn)糖化過程中LOX 的酶活Fig.6 Change of LOX activity during brewing on production scale

3 結(jié)論

3.1 啤酒麥芽中含有一定的脂肪氧化酶，其活性受麥芽品種和焙焦強(qiáng)度影響，相對而言，澳大利亞和法國大麥制成的麥芽的脂肪氧化酶活性較低，國產(chǎn)大麥制成的麥芽其脂肪氧化酶往往較高，另外，提高焙焦強(qiáng)度可以降低成品麥芽脂肪氧化酶的活性。

3.2 脂肪氧化酶的存在的確會引起脂肪酸的氧化，導(dǎo)致啤酒的老化程度提高，抗氧化性能下降。

3.3 麥芽的脂肪氧化酶在pH4.5～8.5 之間均有一定的活性，其中在pH6.5，酶活最高，為最適pH，當(dāng)pH小于4 或高于9 時，LOX 的催化活性幾乎完全被抑制。麥芽的脂肪氧化酶在20℃到40℃之間表現(xiàn)出平穩(wěn)且較強(qiáng)的催化活性，但當(dāng)反應(yīng)溫度小于20℃時，脂肪氧化酶的催化活性急劇下降，而當(dāng)反應(yīng)溫度高于40℃時，脂肪氧化酶的催化活性則平穩(wěn)下降，這可能是由于麥芽中含有兩種脂肪氧化酶同功酶。麥芽的脂肪氧化酶在50℃以內(nèi)，表顯出較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性，但是當(dāng)溫度在60℃及以上時則迅速失活。

3.4 大麥經(jīng)過浸麥之后，其中的脂肪氧化酶活性下降，但是之后的發(fā)芽階段迅速增加，發(fā)芽最后一天酶活為原大麥的5 倍，但是經(jīng)過焙焦之后，酶活又大幅度下降，甚至低于原大麥的脂肪氧化酶活性。

3.5 在糖化過程中，當(dāng)醪液的溫度低于60℃時，醪液中能檢測出脂肪氧化酶的活性，是脂肪氧化酶催化氧化脂肪酸的關(guān)鍵階段。

［1］Boivin P.Pro-and anti-oxidant enzymatic activity in malt［J］.Cerevisia，2001，26(2):109-115.

［2］Vanderhaegen B，Neven H，Verachtert H，et al.The chemistry of beer aging-a critical review［J］.Food Chemistry，2006，95(3):357-381.

［3］Bamforth C W.Enzymic and non-enzymic oxidation in the brewhouse:A theoretical consideration［J］.Journal of the Institute of Brewing，1999，105(4):237-242.

［4］Pinto Mdel C，Tejeda A，Duque A L，et al.Determination of lipoxygenase activity in plant extracts using a modified ferrous oxidation-xylenol orange assay［J］.J Agric Food Chem，2007，55(15):5956-9.

［5］Patui S，Peresson C，Braidot E，et al.Lipoxygenase distribution in coffee(coffea arabica l.)berries［J］.J Agric Food Chem，2007，55(20):8223-30.

［6］Baxter E D.Lipoxidases in malting and mashing［J］.Journal of the Institute of Brewing，1982，88(6):390-396.

［7］Hirota N，Kuroda H，Takoi K et al.Brewing performance of malted lipoxygenase-1 null barley and effect on the flavor stability of beer［J］.Cereal chemistry，2006，83(3):250-254.

［8］Hirota N，Kuroda H，Takoi K，et al.Development of novel barley with improved beer foam and flavor stability-:The impact of lipoxygenase-1- less barley in the brewing industry［J］.Technical quarterly-Master Brewers Association of the Americas，2006，43(2):131-135.

［9］Bamforth C，Clarkson S，Large P.The relative importance of polyphenol oxidase，lipoxygenase and peroxidases during wort oxidation［C］. Proceedings of the Congress of the European Brewery Convention，Lisbon，1991:617-624.

［10］Yang G，Schwarz P B.Activity of lipoxygenase isoenzymes during malting and mashing［J］.Journal of the American Society of Brewing Chemists，1995，53(2):45-49.

［11］Roberto B d A，Leif-Alexander G，Renate N，et al.Regioand stereoselectivity of malt lipoxygenases lox1 and lox2［J］.Journal of the Institute of Brewing，2005，111(3):265-274.

［12］Liégeois C，Meurens N，Badot C，et al.Release of deuterated(e)- 2 - nonenal during beer aging from labeled precursors synthesized before boiling［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2002，50(26):7634-7638.

［13］Douma A C，Doderer A，Cameron- mills V，et al. Low lipoxygenase 1 barley:US，20030167544A1［P］.20030904.

［14］Grigsby J H，Palamand S R.Studies on the staling of beer:The use of 2-thiobarbituric acid in the measurement of beer oxidation［J］. Journal of the American Society of Brewing Chemists，1976，34(2):49-55.

［15］Parsons R，Cope R.The assessment and prediction of beer flavor stability［C］.Proceedings of the Congress of the European Brewery Convention，London，1983:279-286.

［16］靳紀(jì)培，董建軍，劉景，等.啤酒風(fēng)味老化評價的研究進(jìn)展［J］.食品工業(yè)科技，2008，29(7):273-276.

［17］McGivney K.Tba test as an indicator for flavour stability:Thiobarbituric acid index for wort and beer［J］.Journal of the American Society of Brewing Chemists，2008，66(4):264-265.

［18］Schwarz P B，Pyler R E.Lipoxygenase and hydroperoxide isomerase activity of malting barley［J］.Journal of the American Society of Brewing Chemists，1984，42(2):47-53.

［19］Kaukovirta-Norm A，Laakso S，Reinikainen P，et al.Lipolytic and oxidative changes of barley lipids during malting and mashing［J］.Journal of the Institute of Brewing，1993，99(5):395-403.

［20］Frederiksen A M，F(xiàn)estersen R M，Andersen M L.Oxidative reactions during early stages of beer brewing studied by electron spin resonance and spin trapping［J］.Journal of Agricultural and Food chemistry，2008，56(18):8514-8520.