石榴酒發(fā)酵生產(chǎn)工藝及褐變研究

熊 亞，李敏杰，覃 懿

(1.攀枝花學院生物與化學工程學院，四川攀枝花617000;2.攀枝花市干熱河谷特色生物資源工程技術(shù)中心，四川攀枝花617000;3.四川農(nóng)業(yè)大學資環(huán)學院，四川雅安625000)

石榴是石榴科植物石榴的果實，又名安石榴、丹若、金嬰、天漿等。成熟的石榴皮色鮮紅或粉紅，常會裂開，露出晶瑩如寶石般的子粒，酸甜多汁，回味無窮［1］。石榴汁中含有豐富營養(yǎng)物質(zhì)，如維生素、礦物質(zhì)、碳水化合物以及人體必需的多種微量元素［2］。研究表明石榴的營養(yǎng)成分如下:含糖量:7.5% ～11.8%，可溶性固體物:16%，總酸:2.24%～5.5%，還有蛋白質(zhì)、維生素C 和豐富的礦物質(zhì)元素和17 種必需氨基酸，其中含鈣、鐵、磷的量很高，對于健康起著重要作用［3］。石榴果食用較不方便，將其加工為具有較高附加值且保留其營養(yǎng)成分的果酒產(chǎn)品，不僅可以增加農(nóng)民收入，還可以減少運輸、儲存過程中的損失，擴大石榴的銷路。同時由于石榴酒在加工、銷售、儲存過程中容易發(fā)生褐變，嚴重影響了石榴酒的感官質(zhì)量，也將嚴重影響其經(jīng)濟效益。根據(jù)前人的研究，影響褐變的因素可分為:酶促褐變和非酶促褐變［4］。酶促褐變:是在有氧的條件下，酚酶催化酚類物質(zhì)形成醌及其聚合物的反應過程。非酶促褐變:研究表明含有酚酸(主要有表兒茶素的衍生物、兒茶素、沒食子酸、咖啡酸、花青素)和鄰羥基酚結(jié)構(gòu)的類黃酮在石榴酒的褐變機制中很重要，其中黃烷-3-醇衍生物被科學家認為是非酶促氧化褐變最有用的基質(zhì)，它的含量與褐變程度有重要的關(guān)系［5］。所以，石榴酒褐變主要是氧化褐變。本實驗以石榴為原料生產(chǎn)發(fā)酵果酒，主要對石榴果酒的生產(chǎn)工藝進行優(yōu)化，也對石榴酒的氧化褐變的抑制進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

石榴 采自四川省攀枝花市仁和區(qū)大田鎮(zhèn);果膠酶 江蘇銳陽生物科技有限公司，酶活:30 萬U;安琪葡萄酒高活性干酵母 安琪酵母股份有限公司，酵母數(shù)量:1 ×1010個/g。

BL610 電子天平 上海精天電子儀器有限公司;托盤天平 榮成市晟博機械公司、10609CHO 手持折光儀 鄭州南北儀器設(shè)備公司;電爐 寧波東方公司，752 型紫外可見分光光度計 上海恒平科學儀器有限公司;冰箱 青島海爾股份有限公司產(chǎn)品;BM255 果汁機 美的集團有限公司。

1.2 工藝流程

1.3 分析檢測方法

酒精度的測定:蒸餾法［6］;總酸(以檸檬酸計)含量的測定:滴定法;揮發(fā)酸(以醋酸計)含量的測定:蒸餾法;總糖含量的測定:斐林試劑法;細菌總數(shù)的測定:稀釋平板計數(shù)法;大腸菌群:乳糖膽鹽發(fā)酵法［7］。透光率的測定:分光光度法。

1.4 工藝要點

選料:選擇新鮮完好、成熟度較高的石榴，首先看品種，一般是黃色的最甜。其次看光澤，如果光滑到發(fā)亮那說明石榴新鮮的，表面如果有黑斑的話，則說明不新鮮了。再次拈重量了，較重的是熟透了的，里面水分會比較多。最后看石榴的皮是不是很飽滿，就是皮和里面的肉很緊繃的那樣，否則就代表石榴不新鮮了。

去皮:將成熟的石榴剝?nèi)ネ馄?，包括果肉之間的黃色組織，人工去皮，去皮時并應去凈爛肉、斑點。

榨汁:將去皮后的石榴進行榨汁，榨汁時不能加過多的水，加水量控制在10%～20%，同時加入亞硫酸和果膠酶［8］。

酶解:石榴果實中含有大量果膠，會影響石榴籽的出汁率，所以在榨汁時添加果膠酶，可提高酶解效率［9］，以除去果膠。添加果膠酶后，在常溫下進行攪拌澄清，并靜置24 小時，在過濾后測得石榴籽和殘渣重量可得出汁率。

過濾:將石榴汁用紗布過濾(過濾前應用亞硫酸對紗布進行清洗)濾去石榴籽及殘渣。

糖酸調(diào)整:根據(jù)石榴原汁中的含糖的多少可按比例加入白砂糖，將果汁的糖度調(diào)至20Bx，pH 控制在3.5～4.5［10］。

發(fā)酵:將活化的安琪葡萄酒高活性干酵母接入石榴汁中進行酒精發(fā)酵。在發(fā)酵過程要檢測各種參數(shù)以監(jiān)測發(fā)酵是否順利進行，主要的參數(shù)有溫度、糖度、比重、酸度。起酵后，以醪液的比重判斷發(fā)酵進行的程度，當比重下降到1.000 以下后，檢測糖度，當糖度在4g/L 以下，加入100mg/kg 亞硫酸終止發(fā)酵。并檢測果酒酒精度。

澄清:發(fā)酵結(jié)束后靜置澄清1 周。

過濾:澄清結(jié)束后將酒液倒罐，并將底部沉淀進行過濾。

1.5 單因素實驗

果酒發(fā)酵是經(jīng)過一系列酶的催化作用把發(fā)酵液中的糖轉(zhuǎn)化為CO2、酒精以及其他代謝產(chǎn)物，給予果酒獨特風味的過程。其中發(fā)酵溫度，二氧化硫的添加量和酵母接種量都對發(fā)酵結(jié)果有直接的影響，所以分別進行單因素實驗。根據(jù)酵母的適宜生長溫度范圍，我們選取20～28℃為溫度因素的實驗范圍，當進行實驗時固定另外2 個因素條件，根據(jù)前人研究的結(jié)果我們選取二氧化硫的添加量為60mg/kg，接種量為4%。以發(fā)酵后果酒的酒精度為指標，得出某溫度值為最優(yōu)值。然后以此溫度，接種量4% 為固定值，對二氧化硫的添加量做單因素實驗，得出二氧化硫添加量為多少時為最優(yōu)值。同理，可得接種量的最優(yōu)值。

1.6 正交實驗設(shè)計

由圖1～圖3 可得，以發(fā)酵溫度(℃)、二氧化硫(mg/kg)和酵母菌接種量(%，體積分數(shù))為三個因素，并選取各自最佳值相近的三水平進行正交實驗［11］(見表1)，以發(fā)酵結(jié)束后的酒精度(%)為驗證指標。

1.7 石榴酒褐變的控制

褐變控制方法有:添加適合的抗氧化劑;降低氧化底物含量;降低溶氧濃度;改變催化氧化的條件。在本次實驗中，我們采用降低氧化底物含量方法來抑制褐變，主要是采用加入不同澄清劑的方法實驗澄清效果，得出最佳的澄清劑。選取明膠、PVPP、硅藻土為澄清劑進行比較，結(jié)合前人研究用量為0.04%和0.08%。

表1 果酒發(fā)酵正交實驗Table 1 Orthogonal test of liquor fermentation

2 結(jié)果及分析

2.1 酶解對出汁率的影響

由表2 可知，在果膠酶用量為40mg/kg 時，石榴籽出汁率最高。

表2 酶解對出汁率實驗結(jié)果Table 2 the results of juice yield on Enzymatic Hydrolysis

2.2 單因素實驗結(jié)果

考查發(fā)酵溫度因素對石榴酒酒精度的影響時，固定另外2 個因素條件，即二氧化硫的添加量為60mg/kg，接種量為4%。實驗結(jié)果見圖1。根據(jù)圖1可知，最優(yōu)發(fā)酵溫度為24℃。考查二氧化硫添加量對石榴酒酒精度的影響，得圖2。由圖2 可知二氧化硫最佳添加量為50mg/kg。根據(jù)圖3 可知，最佳接種量為5%。

圖1 發(fā)酵溫度對果酒酒精度的影響Fig.1 Impact of the fermentation temperature on the alcoholic strength of liquor

圖2 二氧化硫添加量對果酒酒精度的影響Fig.2 Impact of the amount of SO2 on the alcoholic strength of liquor

圖3 接種量對果酒酒精度的影響Fig.3 Impact of inoculum size on the alcoholic strength of liquor

正交實驗結(jié)果及方差分析見表3、表4。從表3中可見，石榴酒發(fā)酵的正交實驗中，R1＞R2＞R3，即發(fā)酵溫度對果酒的酒精度影響最大，其次是二氧化硫添加量，再次是接種量。最優(yōu)組合是A2B2C2，即發(fā)酵溫度為24℃，二氧化硫添加量50mg/kg，酵母接種量為5%。由表5 可以看出，發(fā)酵溫度的F 值達到顯著水平，即發(fā)酵溫度的影響具有顯著性。

2.3 正交實驗結(jié)果

2.4 正交實驗結(jié)果驗證

由于從實驗得到的最佳工藝條件組合(A2B2C2)并未包括在正交表的9 個實驗內(nèi)，為了進一步確定結(jié)果，在最佳發(fā)酵條件即發(fā)酵溫度為24℃，二氧化硫添加量50mg/kg，酵母接種量為5% 下進行驗證實驗，得發(fā)酵酒精度為9.9%的石榴果酒(實驗號10)。與正交實驗中最優(yōu)實驗結(jié)果實驗5 號進行對比，結(jié)果見表5。由表5 可知，最佳發(fā)酵條件下的石榴果酒品質(zhì)最好。

表3 發(fā)酵正交實驗結(jié)果Table 3 Results of orthogonal test

表4 方差分析結(jié)果Table 4 Results of variance analysis

表5 正交實驗驗證結(jié)果Table 5 Confirmatory results of orthogonal test

2.5 石榴酒褐變的研究及控制

以明膠、PVPP、硅藻土為澄清劑進行比較，結(jié)果見表6。

表6 不同澄清劑對果酒澄清度的影響Table 6 Impact of different clarifiers on the liquor

由表6 可見，相同添加量時硅藻土的澄清效果最好。再通過不同硅藻土用量的實驗，確定最佳用量。由表7 可以看出，當硅藻土添加量為0.10%時，透光率最高，也就是酒液澄清度最佳。

石榴酒存儲過程中褐變的周期較長，一般采用加速褐變的方法使其快速發(fā)生褐變，以研究澄清劑對褐變的影響。氧化破敗實驗是在50mL 燒杯中加入25mL 石榴酒，放置在室溫下的空氣中5 天，測得透光率的變化可反映酒液褐變程度。實驗結(jié)果見表8。由表8 可知，經(jīng)過澄清劑處理的石榴酒，其褐變程度得到大幅度的抑制。

表7 硅藻土對果酒澄清度的影響Table 7 Influence of the diatomite on the clarity of liquor

表8 氧化對果酒澄清度的影響Table 8 Impact of oxidation on the liquor

2.6 成品品質(zhì)

2.6.1 感官指標 色澤:淡紅色，色澤鮮艷;澄清度:澄清透明，無沉淀及懸浮物;香味:具有濃郁的酒香和石榴特有的芳香氣，香氣柔和，無異味;口味:酸味柔和爽口，滋味純正，酸甜協(xié)調(diào)。

2.6.2 理化指標 總糖(以葡萄糖計)2.5g/L，固形物24.7g/L，酒精度9.9%，總酸(以檸檬酸計)2.7g/L，揮發(fā)酸(以醋酸計)0.09g/L，pH3.6，總SO2146mg/L，游離SO228mg/L。

2.6.3 微生物指標 果酒細菌總數(shù)≤35.00 個/mL;大腸桿菌和致病菌未檢出。產(chǎn)品符合GB/T 15038-2006 標準。

3 結(jié)論

實驗結(jié)果表明，發(fā)酵溫度為24℃，二氧化硫添加量50mg/kg，酵母接種量為5%時，乙醇的濃度可以達到9.9%，是發(fā)酵石榴果酒的最佳生產(chǎn)工藝條件。其中發(fā)酵溫度的影響最大，其次是二氧化硫添加量。石榴籽的處理中添加40mg/kg 的果膠酶可以得到最大的出汁率。

石榴酒的褐變對石榴酒的色澤產(chǎn)生嚴重的影響，同時也影響了石榴酒的經(jīng)濟效益。石榴酒中添加0.10%的硅藻土，可使酒液澄清度最佳，同時也可抑制其褐變。

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