萌發(fā)黑豆幾種生理生化指標(biāo)變化研究

陳鳳清，叢建民 ，杜站宇，姚 娜，婁 雪

(白城師范學(xué)院，吉林白城137000)

黑豆(Glycine max var)又名櫓豆、料豆、零烏豆，呈卵圓形或球形，表皮黑色或深綠色，全國(guó)各地均有生產(chǎn)，以東北產(chǎn)量最多。黑豆的蛋白質(zhì)含量尤為豐富，高于肉類、雞蛋和牛奶，素有“植物蛋白之王”的美譽(yù)［1］。黑豆芽具有黑豆所具有的各種營(yíng)養(yǎng)成分，黑豆在發(fā)芽后更利于人體吸收各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。植物種子發(fā)芽時(shí)細(xì)胞內(nèi)部代謝作用和酶的活性開始啟動(dòng)，使各種內(nèi)含物質(zhì)悄悄轉(zhuǎn)變?yōu)槿芙鉅顟B(tài)，以利水解作用進(jìn)行。黑豆在發(fā)芽后更利于人體吸收其中各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。黑豆富含人體所需的氨基酸、維生素和微量元素等，具有健身滋補(bǔ)、扶正防病、延年益壽等作用［2］，作為藥、食材料廣泛種植。黑豆芽具有黑豆所具有的各種營(yíng)養(yǎng)成分，豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、維生素、碳水化合物和膳食纖維、微量元素，并且含有豐富的維生素A、E，核黃素、黑色素等。種子萌發(fā)過程中，啟動(dòng)等一系列相關(guān)的生理生化變化來(lái)適應(yīng)新的環(huán)境，并與其發(fā)育相關(guān)［3-4］。有關(guān)發(fā)芽黑豆的生理生化指標(biāo)的研究鮮有報(bào)道，本文通過研究黑豆種子和發(fā)芽后酶的活力、功能成分與萌發(fā)時(shí)間的關(guān)系，旨在為進(jìn)一步研究黑豆發(fā)芽發(fā)育生理狀態(tài)與其營(yíng)養(yǎng)變化及合理利用黑豆提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑豆 吉林省白城市洮南金祥鄉(xiāng);所用生化試劑 Sigma 公司的產(chǎn)品，其它試劑為分析純。

FA1004A 精密電子天平 上海精天電子儀器有限公司;T6 紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;Anke GL-20B 飛鴿牌系列高速低溫離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;SPX-250C 恒溫恒濕培養(yǎng)箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;NO.10014，SIGMA 1-14 小型臺(tái)式離心機(jī) 德國(guó)希格瑪離心機(jī)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

選取飽滿、無(wú)病蟲害的黑豆種子稱重后，用25℃水浸泡，于恒溫恒濕培養(yǎng)箱中25℃、400LX、75%濕度培養(yǎng)，并定時(shí)換水，按一定時(shí)間取樣，取樣后用FA1004A 電子分析天平稱重并記錄。每組做三個(gè)重復(fù)，未萌發(fā)的黑豆種子(CK)做對(duì)照。黑豆萌發(fā)后，分別在不同時(shí)間取材，檢測(cè)各種生理生化指標(biāo)。

1.2.1 蛋白質(zhì)含量測(cè)定 參照考馬斯亮藍(lán)法［5］，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 可溶性多糖含量測(cè)定 參照蒽酮法［6］，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 黑豆中多酚的提取及含量測(cè)定 參照茶多酚國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)［7］。

1.2.4 黑豆中抗氧化酶系的提取及活力測(cè)定［8-9］過氧化氫酶(CAT)，超氧化物歧化酶(SOD)，過氧化物酶(POD)，多酚氧化酶(PPO)活力測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線:在488nm 處測(cè)反應(yīng)體系的吸光值，得到葡萄糖濃度C 與吸光值A(chǔ)488的回歸方程:

C =20.18A488-0.09(μg/mL)，r =0.9996，說(shuō)明C與A488的線性關(guān)系良好。

蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線:在595nm 處測(cè)反應(yīng)體系的吸光值，蛋白質(zhì)濃度C 與吸光值A(chǔ)595的得到回歸方程:

C(μg/mL)=27.126A595-0.2825，r =0.9972，說(shuō)明C 與A595線性關(guān)系良好。

2.2 可溶性蛋白質(zhì)含量

黑豆發(fā)芽過程中，可溶性蛋白質(zhì)含量變化見圖1。

圖1 可溶性蛋白質(zhì)含量隨萌發(fā)時(shí)間變化Fig.1 Changes of solubility protein content with germination time

從圖1 可見，黑豆中可溶性蛋白含量在干種子中含量最低，當(dāng)萌發(fā)12～60h 時(shí)，可溶性蛋白含量呈上升趨勢(shì)，當(dāng)發(fā)芽60h 時(shí)，含量最高，達(dá)到134.00mg/g DW;之后趨于穩(wěn)定。黑豆發(fā)芽過程中吸水膨脹后，代謝活力加強(qiáng)，蛋白質(zhì)從非可溶性狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榭扇苄誀顟B(tài)，其轉(zhuǎn)化的可溶性蛋白可為萌發(fā)提供各種酶及可利用的各種活性氨基酸等代謝需要［10］。

2.3 可溶性多糖含量

由圖2 可知，在黑豆未萌發(fā)時(shí)，碳水化合物主要以非可溶性多糖狀態(tài)存在，可溶性多糖含量相對(duì)較低，可溶性多糖含量為48.75mg/g DW，在12h 時(shí)達(dá)到最大值77.47mg/g DW，之后緩慢降低，與種子多糖含量相近。隨萌發(fā)時(shí)間的延長(zhǎng)，作為種子中的貯藏物質(zhì)，碳水化合物在酶的作用下，為生物體提供能量，并為萌發(fā)代謝提供基本材料。表現(xiàn)為種子中非可溶性多糖逐步轉(zhuǎn)化為可溶性多糖，整體上多糖總量在減少，干物質(zhì)量在減少［11］。

圖2 可溶性多糖含量隨萌發(fā)時(shí)間變化Fig.2 Changes of of soluble polysaccharide content with germination time

2.4 多酚含量

多酚是在植物性食物中發(fā)現(xiàn)的、具有潛在促進(jìn)健康作用的化合物。豆芽暴露在空氣中容易發(fā)生褐化，這是豆芽中的多酚物質(zhì)與空氣中的氧發(fā)生氧化作用的結(jié)果，酚類物質(zhì)變?yōu)橄鄳?yīng)的醌類，在有氧狀態(tài)下發(fā)生褐化作用。由圖3 可知，在萌發(fā)12、60h 時(shí)，多酚含量出現(xiàn)兩個(gè)高峰，在12h 前多酚含量增加，而在12～36h 多酚含量略有降低，在36～60h 時(shí)，多酚含量增加幅度大于12h 前，在60h 達(dá)到最高峰1.91mg/g DW;當(dāng)萌發(fā)60h 后，多酚含量減少。

圖3 多酚含量隨萌發(fā)時(shí)間變化圖Fig.3 Change of polyphenol content with germination time

2.5 酶活力測(cè)定結(jié)果及分析

2.5.1 CAT 比活力 由圖4 可知，在培養(yǎng)12h 時(shí)，CAT 比活力表現(xiàn)相對(duì)較強(qiáng)，為35.56U/g Pr。在24～72h 中CAT 比活力相對(duì)較低，在24h 后隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，CAT 比活力有增強(qiáng)趨勢(shì)。CAT 比活力在12h 高，可能與種子吸水膨脹后呼吸強(qiáng)度相對(duì)增強(qiáng)相關(guān)，而在24h 后比活力增強(qiáng)，可能在發(fā)芽發(fā)育啟動(dòng)后，與代謝環(huán)境相關(guān)。CAT 是關(guān)系植物保護(hù)反應(yīng)的關(guān)鍵酶，在發(fā)育代謝中對(duì)于清除種子內(nèi)過多電子傳遞體系中過氧化氫自由基等，減輕生物膜損傷，維持自由基含量的相對(duì)穩(wěn)定，保證正常生長(zhǎng)具有重要作用［12-13］。

圖4 CAT 比活力隨萌發(fā)時(shí)間變化Fig.4 Specific activity of CAT with germination time

2.5.2 SOD 比活力 生物在生長(zhǎng)條件下，會(huì)產(chǎn)生活性氧脅迫，活性氧的累積主要是由大量的超氧自由基所致，超氧自由基可通過酶促反應(yīng)歧化生成H2O2和O2，或產(chǎn)生氧化活性更強(qiáng)的羥基自由基(·OH)，對(duì)于清除超氧自由基起關(guān)鍵作用的是SOD［14］。

由圖5 可知，隨著萌發(fā)時(shí)間的延長(zhǎng)，SOD 比活先增加后降低，并在48h 后隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而明顯減弱，并低于種子中SOD 酶比活力。在干種子中SOD 比活力為85.88U/g Pr，在萌發(fā)24h 時(shí)，SOD 比活力最強(qiáng)為299.33U/g Pr，之后隨著萌發(fā)時(shí)間的延長(zhǎng)，SOD 比活力有所減弱，72h 時(shí)SOD 比活力為83.44U/g Pr。

圖5 SOD 比活力隨萌發(fā)時(shí)間變化Fig.5 Specific activity of SOD with germination time

2.5.3 POD 比活力 黑豆萌發(fā)過程中代謝產(chǎn)生如過氧化氫、酚類和胺類化合物等對(duì)機(jī)體有毒性的化合物及某些雜環(huán)化合物，對(duì)機(jī)體是具有損傷的，通過自身的過氧化物酶的活性來(lái)消除過多的過氧化物的損害，維持機(jī)體正常代謝［15］。植物在吸水后生長(zhǎng)代謝初期產(chǎn)生大量的過氧化物，POD 催化對(duì)生物自身有毒害的過氧化物的氧化和分解，以維持自身的正常代謝，從而誘導(dǎo)了POD 活性的增加［16］。由圖6 可知，隨黑豆發(fā)芽時(shí)間延長(zhǎng)，POD 活性發(fā)生改變。在種子中POD 比活力為6.35U/g Pr，在12h 時(shí)達(dá)到最高，為67.98U/g Pr，之后比活力下降，72h 時(shí)POD 比活力為20.28U/g Pr。

圖6 POD 比活力隨萌發(fā)時(shí)間變化Fig.6 Specific activity of POD with germination time

2.5.4 PPO 比活力 黑豆在萌發(fā)過程中多酚氧化酶比活力發(fā)生改變，是其發(fā)育中多酚物質(zhì)在不同時(shí)期下發(fā)生變化相適應(yīng)的結(jié)果。由圖7 可知，PPO 比活力在種子中為21.00U/g Pr，培養(yǎng)12h 時(shí)最強(qiáng)為64.09U/g Pr，之后隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，PPO 比活力有所減弱，72h 時(shí)PPO 比活力為9.47U/g Pr。發(fā)芽黑豆在培養(yǎng)了36h 后，PPO 比活力比對(duì)照降低。

圖7 PPO 比活力隨萌發(fā)時(shí)間與變化Fig.7 Specific activity of PPO with germination time

3 結(jié)論與討論

3.1 黑豆中含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、維生素、微量元素和粗纖維，具有高蛋白、低熱量的特性，其中蛋白質(zhì)含量達(dá)40%以上，黑豆蛋白質(zhì)中的必需氨基酸組成結(jié)構(gòu)水平總體優(yōu)于黃豆，具體的每一種必需氨基酸含量均高于雞蛋，居豆類之首;脂肪含量也高達(dá)15.19%，組成脂肪的脂肪酸以不飽和為主。黑豆中微量元素如鋅、銅、鎂、硒、磷等的含量都很高，并且含豐富的VA、VE、核黃素、黑色素等多種維生素［17］。黑豆皮質(zhì)厚，不易消化吸收和利用，通過發(fā)芽技術(shù)改善黑豆的質(zhì)構(gòu)、營(yíng)養(yǎng)、生物活性以及人體實(shí)際利用率已成為研究熱點(diǎn)。孫肖青等［18］研究發(fā)現(xiàn)黑豆萌發(fā)后其游離異黃酮苷元成分增加，王薇等［19］發(fā)現(xiàn)萌發(fā)不同萌發(fā)時(shí)期內(nèi)VC含量增加，翟瑋瑋等［20］發(fā)現(xiàn)發(fā)芽過程中蛋白質(zhì)、必需氨基酸和非必需氨基酸的含量增加顯著，內(nèi)源蛋白酶活力先增加后降低;蛋白質(zhì)平均相對(duì)分子質(zhì)量顯著下降;γ-氨基丁酸含量顯著增加。

3.2 種子萌發(fā)吸取一定量的水分后，細(xì)胞內(nèi)部代謝作用和酶的活性開始啟動(dòng)，使種子內(nèi)含物質(zhì)悄悄轉(zhuǎn)變?yōu)槿芙鉅顟B(tài)，以利水解作用進(jìn)行［12］。黑豆種子萌發(fā)后細(xì)胞內(nèi)啟動(dòng)相同的生理作用。本文通過研究發(fā)芽黑豆的可溶性蛋白、可溶性多糖、多酚含量變化，發(fā)現(xiàn)在種子中可溶性蛋白含量最低;在萌發(fā)12～60h內(nèi)，隨萌發(fā)時(shí)間延長(zhǎng)，可溶性蛋白含量上升;在發(fā)芽60h 時(shí)達(dá)到最高，134.00mg/g DW?？扇苄远嗵呛吭诤诙刮疵劝l(fā)時(shí)為 48.75mg/g DW，在 12h 為77.47mg/g DW，達(dá)到最大值，之后緩慢降低。多酚含量在萌發(fā)12、60h 內(nèi)出現(xiàn)兩個(gè)高峰，在萌發(fā)36 ～60h內(nèi)，多酚含量增加幅度大于12h 內(nèi)的多酚增加量;在60h 達(dá)到最高峰，為1.91mg/g DW，在60h 后，多酚含量減少。

3.3 生物種子萌發(fā)時(shí)，其貯藏物質(zhì)的分解與新器官中結(jié)構(gòu)物質(zhì)合成，均需靠酶的催化作用［12］。檢測(cè)黑豆及萌發(fā)期的幾種酶比活力發(fā)現(xiàn)CAT 比活力在培養(yǎng)12h 中表現(xiàn)相對(duì)較高活力，為35.56U/g Pr，24～72h 活力相對(duì)逐漸增加;在萌發(fā)24h 時(shí)，SOD 比活力最強(qiáng)，為299.33U/g Pr，之后隨著萌發(fā)時(shí)間的延長(zhǎng)，SOD 比活力有所減弱;POD 酶比活力在12h 時(shí)達(dá)到最高，為67.98U/g Pr，之后POD 比活力下降:PPO 比活力在萌發(fā)12h 時(shí)最強(qiáng)，為64.09U/g Pr，之后隨著萌發(fā)時(shí)間的延長(zhǎng)，PPO 比活力有所減弱。

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