白果揮發(fā)性物質(zhì)的頂空固相微萃取條件篩選及成分分析

王 蓉，徐志楊，畢 陽，* ，寇宗紅

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730070;2.泰州市集泰農(nóng)產(chǎn)品有限公司，江蘇泰州225300)

銀杏屬于銀杏科(Ginkgo biloba L.)落葉高大喬木，在我國廣泛栽培，是我國主要的經(jīng)濟(jì)樹種之一。其果實白果具有營養(yǎng)和功能雙重功效，不僅富含淀粉、蛋白質(zhì)和脂肪，還含有多糖、黃酮、銀杏內(nèi)酯、銀杏酸等多種功能成分，具有潤肺、定喘、澀精、止帶，調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、抗衰老、降壓降脂等作用［1］。國內(nèi)外關(guān)于白果仁品質(zhì)的報道不多，現(xiàn)有文獻(xiàn)除報道其營養(yǎng)成分和功能因子外［2］，還對其有毒成分進(jìn)行了分析［3］，但尚未見白果仁香氣方面的研究報道。由于香氣是反映果實感官品質(zhì)的重要指標(biāo)，在評價其品質(zhì)及控制貯藏和加工過程具有十分重要的影響。因此，有必要對白果仁的香氣開展研究。本文擬對影響白果仁揮發(fā)性物質(zhì)的固相微萃取條件進(jìn)行篩選，并采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)分析各類揮發(fā)性組分，以豐富白果的品質(zhì)內(nèi)容，為白果貯藏和加工過程的風(fēng)味控制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

白果(Ginkgo biloba L.，品種大佛指)于2011 年9月采自江蘇泰州。

氣相色譜- 質(zhì)譜聯(lián)用儀(Agilent 6890 GC -5973MSD);色譜柱(OV1701 60m ×0.25mm(i.d)×0.5μm，蘭州化物所);固相微萃取器(SPME，50/30μm DVB/CAR/PDMS，美國SUPELCO 公司)。

1.2 樣品制備

參考楊繼紅等［4］方法，選擇無霉變、無硬心的銀杏為原料，去除變質(zhì)果并用清水漂洗，除去白果殼及外衣，置于-80℃低溫冰箱中冷凍6h 后取5～6 顆切片于研缽中。加液氮后迅速研磨成粉末，準(zhǔn)確稱取5g 于頂空瓶中迅速密封，置于-4℃冷凍備用。

1.3 頂空固相微萃取

參照蔣玉梅方法［5］，將裝有樣品的頂空瓶在室溫解凍后，置于60℃水浴中恒溫10min。將經(jīng)老化處理的萃取頭插入頂空瓶中，于一定溫度條件下恒溫吸附一定時間，抽回纖維頭并拔出萃取頭，迅速將萃取頭插入氣相色譜儀進(jìn)樣口，推出纖維頭，于250℃解析10min，抽回纖維頭后拔出萃取頭，同時啟動儀器采集數(shù)據(jù)。

1.4 萃取條件的篩選

1.4.1 溫度 根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，設(shè)置溫度在50、60、70℃四個水平條件下萃取45min，通過測定揮發(fā)性成分的萃取效果，確定最佳萃取溫度。

1.4.2 時間 根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，萃取頭在60℃條件下分別萃取30、45、60min，通過測定揮發(fā)性成分的萃取效果，確定最佳萃取時間。

1.4.3 樣品量 根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，分別將3、5、7g 樣品加入頂空瓶中，萃取頭在60℃下萃取45min，通過測定揮發(fā)性成分的萃取效果，確定最佳樣品量。

1.5 GC-MS 測定條件

色譜條件:進(jìn)樣口溫度250℃，載氣(He)流速1.0mL/min，升溫程序起始溫度100℃保持2min，以3℃/min 升溫至220℃，保留2min，再以5℃/min 升至終溫250℃，保留10min。

質(zhì)譜條件:電子轟擊(EI)離子源，電子能量70eV，傳輸線溫度270℃，離子源溫度230℃，四級桿溫度150℃，倍增管電壓1752.9V，質(zhì)量掃描范圍m/z 20～500amu。

1.6 數(shù)據(jù)處理

樣品中各揮發(fā)性成分的定性由計算機(jī)檢索與NIST 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫匹配求得;揮發(fā)性成分的定量由計算機(jī)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，按照峰面積的歸一化方法進(jìn)行定量分析，計算相對含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 固相微萃取條件的篩選

2.1.1 萃取溫度的篩選 隨著萃取溫度的升高揮發(fā)性醛類化合物的總峰面積逐漸增大，70℃時達(dá)到最大，分別高出50℃和60℃的89.51%和59.4%，揮發(fā)性醇類和萜類隨萃取溫度的升高變化不大(圖1A)，總峰面積隨溫度的升高而增加，是因為溫度升高加快分子運動，有利于萃取吸附，使吸附到萃取頭的物質(zhì)含量增加［6］。這與Eva 在葡萄中研究結(jié)果一致［7］。隨著溫度升高揮發(fā)性化合物的種類也隨之增加，在60℃時達(dá)到最大，高出50℃的9.09%，但當(dāng)溫度升高至70℃時化合物種類有所減少(圖1B)，低于60℃的4.55%。由于溫度升高會引起涂層中某些揮發(fā)性成分的脫附［8］。因此，為了更好的萃取白果揮發(fā)性組分選擇60℃為最佳溫度。

2.1.2 萃取時間的篩選 隨著萃取時間的延長揮發(fā)性醛類的總峰面積逐漸增大，45min 時達(dá)到最大，高出30min 的85.72%，但當(dāng)時間延長至60min 時，總峰面積反而減少;隨著萃取時間的延長揮發(fā)性醇類的總峰面積也逐漸增大，同樣的45min 時達(dá)到最大，高出30min 的61.11%，當(dāng)時間延長至60min 時，揮發(fā)性醇類總峰面積反而減少;揮發(fā)性萜類隨萃取時間的延長變化不大(圖2A)。同樣，萃取45min 時的物質(zhì)種類也最多，分別高出30 和60min 的22.73% 和25%(圖2B)。萃取45min 在總峰面積和物質(zhì)種類方面表現(xiàn)最佳的原因是隨著萃取時間的延長萃取頭所吸附的揮發(fā)性化合物不斷增加，在45min 時達(dá)到最大，隨著時間的延長部分揮發(fā)性成分會從萃取頭上解析出來，從而造成總峰面積和物質(zhì)種類的降低［9］。此外，萃取時間過長還會使一些性質(zhì)不穩(wěn)定揮發(fā)性成分發(fā)生熱分解和氧化等副反應(yīng)［10］。因此，選擇45min 為最佳白果揮發(fā)性化合物萃取時間。

圖1 不同萃取溫度對主要揮發(fā)性物質(zhì)總峰面積(A)和物質(zhì)種類(B)的影響Fig.1 Effect of extraction temperature on main GC peak area(A)and number of volatile compounds(B)

2.1.3 樣品量的篩選 隨著樣品量的增加萃取出的揮發(fā)性醛類化合物的總峰面積呈先下降再升高的趨勢，5g 時達(dá)到最小，分別低于3、7g 的16.24% 和4.16%(圖3A)，這與Riu 等的研究結(jié)果一致［11］。隨著樣品量增加揮發(fā)性化合物的種類增加，在5g 時達(dá)到最大，分別高出3g 和7g 的4.55%和18.18%(圖3B)，這可能是由于樣品量過大，可能導(dǎo)致含量高的揮發(fā)性化合物吸附較多而其他一些揮發(fā)性化合物未被吸附［12］，為了更好的萃取鮮白果仁的揮發(fā)性組分以選擇5g 樣品為最佳樣品量。

2.2 揮發(fā)性成分分析

采用上述優(yōu)化條件萃取白果仁揮發(fā)性物質(zhì)，熱解析后GC-MS 分離鑒定，得到總離子流色譜圖(圖4)。

通過計算機(jī)檢索和人工解譜，共檢出揮發(fā)性化合物44 種(表1)。其中醛類14 種、醇類10 種、烷烴8 種、萜類5 種、酯類3 種、芳烴類2 種，其他類2 種(表1)。揮發(fā)性成分主要集中在色譜圖后半段(圖4)，且主要是一些長鏈的不飽和醛類(表1)，應(yīng)該屬于沸點較高成分。

圖2 不同萃取時間對主要揮發(fā)性物質(zhì)總峰面積(A)和物質(zhì)種類(B)的影響Fig.2 Effect of extraction time on main GC peak area(A)and number of volatile compounds(B)

圖3 不同樣品量對主要揮發(fā)性物質(zhì)總峰面積(A)和物質(zhì)種類(B)的影響Fig.3 Effect of extraction sample weights on mian GC peak area(A)and number of volatile compounds(B)

本研究結(jié)果表明50/30μmDVB/CAR/PDMS 纖維頭對白果的香氣具有良好的萃取效果，該萃取頭具有DVB 涂層孔徑大和CAR 涂層小孔多的優(yōu)點，它對香氣成分的選擇性好、萃取容量大，萃取效果最好。因此被選用做分析C3-C20 大范圍揮發(fā)性成分，特別是對醛類、醇類、萜烯類和酮類物質(zhì)的吸附明顯高于其它纖維頭［13］。

圖4 鮮白果仁揮發(fā)性成分的總離子流圖Fig.4 Total ion chromatogram of volatiles compounds of fresh Ginkgo biloba seeds

醛類是白果仁揮發(fā)性成分的主體，總含量高達(dá)71.46%，其中不飽和醛比例較高，為39.73%，由于不飽和醛具有醛香、蠟香、脂肪香、草香以及清香等氣味，它們的閾值較低［14］，可能對白果的特征風(fēng)味具有較大的貢獻(xiàn)。但其中含量較高的(7Z，10Z)-十六二烯醛、(13Z)-十八烯醛、(9Z)-十六烯醛尚未見有相關(guān)特征風(fēng)味的報到。含量相對較少的飽和醛主要由不飽和脂肪酸降解產(chǎn)生，表現(xiàn)草本味［15］，其中肉豆蔻醛的含量最高，該物質(zhì)主要表現(xiàn)出蠟味和果味［16］。

醇類是鑒定出的第二大類物質(zhì)，總含量16.81%，它們的閾值較低，可能對白果風(fēng)味有一定的貢獻(xiàn)。其中含量較高的是2，3-丁二醇5.98%，存在于山核桃［17］、美 國 大 杏 仁［4］中，其 次 是1 - 庚 烯-3 - 醇2.18%，表現(xiàn)出青草味和刺激味，在荔枝［18］和香竹竹葉［19］中均檢測到。

白果中檢測到了5 種萜烯類，總含量1.57%，多為呈香物質(zhì)，閾值低，且相互增效，是重要的食用香精原料［20］主要是一些倍半萜類。萜烯類含量較高的δ-杜松烯略帶木頭香氣，存在于紅象牙晚熟芒果［21］和生姜［22］中;α-古蕓烯具有古蕓香脂香氣，在紫花芒果果肉中［23］檢測到。

檢測到的3-羥基-2-丁酮含量相對較高，為4.95%，具有令人愉快的奶油香氣，烤花生［24］和速凍甜玉米［25］中均檢測到。

3 結(jié)論

采用頂空固相微萃取技術(shù)(HS-SPME)可有效萃取白果中的揮發(fā)性成分，萃取的最佳條件為:溫度60℃，時間45min，樣品量5g。通過結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)對萃取的揮發(fā)性成分進(jìn)行分離、定性，共檢出揮發(fā)性化合物44 種，分別鑒定出醛類14種、醇類10 種、烷烴8 種、萜類5 種、酯類3 種、芳烴類2 種、其他類2 種。醛類是白果仁揮發(fā)性成分的主體，其中含量較高的不飽和醛可能對白果仁的特征風(fēng)味具有貢獻(xiàn)。

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表1 鮮白果仁揮發(fā)性成分的GC-MS 分析結(jié)果Table 1 GC-MS analytical results of volatiles compounds of fresh Ginkgo biloba seeds

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