南方紅豆杉多糖的含量測(cè)定及體外降血糖活性研究

湯 彬，薛 平，李 祥 ，陳建偉，邱海龍，張奉蘇

(南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇南京210046)

南方紅豆杉別名美麗紅豆杉、紅榧、紅葉水杉、海羅松、矮杉，是中國(guó)所特有的紅豆杉科紅豆杉屬植物。國(guó)家Ⅰ級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生植物，其幼嫩枝葉和種子都可作藥用。藥用南方紅豆杉幼嫩枝葉，性味苦，平;民間也有用于治療糖尿?。?］?！吨兴幋筠o典》、《本草綱目》、《中華藥?！分杏涊d:紅豆杉有利尿、通經(jīng)、降血脂作用，對(duì)腎病、惡性腫瘤、高血壓、高血脂癥、糖尿病有獨(dú)特療效。近些年對(duì)紅豆杉資源的利用主要集中在紫杉烷類物質(zhì)上，對(duì)其中其他類活性成分如黃酮類、木質(zhì)素類、糖苷類、酚酸類和多糖等［2-4］研究很少。近年來，大量研究表明，多糖除了有增強(qiáng)免疫力、抗腫瘤、抗氧化、抗衰老、消化系統(tǒng)保護(hù)作用的生物學(xué)活性外，還有抗菌、抗病毒、降血糖、降血脂、抗輻射、抗凝血等作用［5-7］。東北紅豆杉多糖具有降血糖活性［8］，而對(duì)南方紅豆杉多糖的研究很少。本文對(duì)南方紅豆杉枝葉中活性多糖進(jìn)行了含量測(cè)定，并以HepG2 細(xì)胞和α-葡萄糖苷酶作為體外受體模型，對(duì)其體外降血糖活性做了初步的研究，為后續(xù)研究其體內(nèi)降血糖及作用機(jī)制提供一定的研究基礎(chǔ)和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

南方紅豆杉枝葉 購(gòu)于無錫紅豆集團(tuán)南方紅豆杉種植基地，藥材經(jīng)本院陳建偉教授鑒定為紅豆杉科南方紅豆杉Taxus chinensis var.mairei，飲片標(biāo)本現(xiàn)保存于本校藥學(xué)院中藥化學(xué)實(shí)驗(yàn)室;葡萄糖對(duì)照品、95%乙醇、無水乙醇、丙酮、乙醚、氯仿、正丁醇、濃硫酸等其他試劑 國(guó)產(chǎn)分析純;HepG2 細(xì)胞 南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院;含酚紅DMEM 高糖培養(yǎng)基 Gibco公司;胎牛血清 杭州四季青生物工程材料有限公司;四甲基偶氮唑鹽(MTT) Sigma 公司;鹽酸二甲雙胍 上海衡山藥業(yè)有限公司;葡萄糖測(cè)定試劑盒 南京建成生物工程研究所;胰島素 江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司;超純水。

紫外可見分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司;超凈工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司;酶標(biāo)儀 美國(guó)BioTek 公司;倒置相差顯微鏡 日本OLYMPUS 公司;CO2培養(yǎng)箱 日本三洋(SANYO)公司;超純純水儀 南京易普易達(dá)科技發(fā)展有限公司;美國(guó)Corning-Coastar 細(xì)胞培養(yǎng)瓶、細(xì)胞培養(yǎng)板 上海艾研生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 南方紅豆杉粗多糖的提取 稱取干燥的紅豆杉枝葉適量，打粉過10 目篩，混合均勻，第一次加8倍量的水，提取2h，第二次加6 倍量的水，提取1h，兩次提取液合并，3000r/min 離心，保留上清液，減壓濃縮，濃縮液加入95%乙醇至體積分?jǐn)?shù)為80%，充分?jǐn)嚢韬箪o置24h，3000r/min 離心15min，棄去濾液。將所得沉淀依次用無水乙醇、丙酮、乙醚多次洗滌，30℃真空干燥，即得南方紅豆杉粗多糖。

1.2.2 南方紅豆杉多糖的含量測(cè)定

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 精密稱取105℃干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品10.55mg，加適量水溶解，轉(zhuǎn)移至100mL 容量瓶中，加水至刻度，搖勻，得到0.1055mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用。

1.2.2.2 苯酚溶液的制備 稱取重蒸苯酚5.0g，加適量水溶解，轉(zhuǎn)移至100mL 棕色容量瓶中，加水至刻度，搖勻，得到5%苯酚溶液，備用。

1.2.2.3 供試品溶液的制備 精密稱取南方紅豆杉多糖粉末16.68mg，加適量水溶解，室溫下超聲15min，轉(zhuǎn)移至100mL 容量瓶中，定容，作為供試品溶液，備用。

1.2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1、0.2、0.4、0.5、0.7、0.8、0.9mL 置于10mL 具塞試管中，分別加水補(bǔ)齊至1.0mL，取超純水1.0mL 作為空白對(duì)照，加入5%苯酚溶液1.0mL 充分混合后，迅速加入濃硫酸5.0mL，充分混合，室溫放置5min 后置沸水中反應(yīng)15min。取出并迅速插入冰水浴放置10min，于489nm 處測(cè)定吸收度。以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度A 為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2.5 南方紅豆杉藥材中多糖的含量測(cè)定 精密吸取供試品溶液1.0mL 置于10mL 具塞試管中，取超純水1.0mL 作為空白對(duì)照，按“1.2.2.4”下方法測(cè)定，計(jì)算南方紅豆杉藥材中多糖的含量。多糖含量(%)=(CDVW×103)/m ×100%，式中:C 為供試品溶液中葡萄糖的濃度(μg /mL)，D 為稀釋倍數(shù)，V 為供試品溶液的體積(mL)，W 為藥材中粗多糖的得率，m為供試品的質(zhì)量(mg)。

1.2.3 南方紅豆杉粗多糖的體外降血糖活性的測(cè)定

1.2.3.1 HepG2 細(xì)胞體外受體模型 HepG2 細(xì)胞的培養(yǎng):HepG2 細(xì)胞復(fù)蘇后采用含10% 胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待貼壁長(zhǎng)滿后，用0.25%胰蛋白酶消化，每3d 1∶3 傳代一次，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

胰島素抵抗HepG2 細(xì)胞模型的葡萄糖消耗實(shí)驗(yàn)及MTT 實(shí)驗(yàn):按文獻(xiàn)方法［9-10］稍作改進(jìn)，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞消化后，用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為5 ×104個(gè)/mL，接種于96 孔培養(yǎng)板中，每孔100μL 細(xì)胞懸液。本實(shí)驗(yàn)設(shè)正常對(duì)照組、模型組、二甲雙胍組(終劑量為10-3mol/L)、南方紅豆杉粗多糖組(終劑量分別為0.5、0.1、0.05、0.01、0.005mg/mL)。待細(xì)胞單層貼壁后，模型組更換新配制的含有胰島素濃度為5 × 10-7mol/L 的DMEM 高糖培養(yǎng)基，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24h，以造成胰島素抵抗細(xì)胞模型。棄去培養(yǎng)基，給藥組加入不同濃度的不含血清的含藥培養(yǎng)基，正常對(duì)照組及模型組則加入不含血清的培養(yǎng)基，各組均包括含生理胰島素組與不含生理胰島素組。于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24h 后，用葡萄糖臨床試劑盒檢測(cè)培養(yǎng)基中的葡萄糖含量，計(jì)算各組細(xì)胞的葡萄糖消耗量。

葡萄糖消耗實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，每孔加入5g/LMTT 溶液20μL，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，4h 后終止培養(yǎng)，小心吸棄孔中的培養(yǎng)基，每孔加入150μLDMSO，振蕩器振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶標(biāo)儀490nm 波長(zhǎng)下測(cè)定各孔的吸光度值，以檢測(cè)細(xì)胞的數(shù)目與活力。

1.2.3.2 α-葡萄糖苷酶體外受體模型 南方紅豆杉粗多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用:參考文獻(xiàn)［11 -12］的反應(yīng)體系，96 孔板上加磷酸鉀緩沖液(pH6.8)110μL，再加入0.2U/mLα- 葡萄糖 苷 酶20μL，10μL 樣品溶液，混勻，37℃恒溫15min 后，加入2.5mmol/L PNPG 20μL，混勻后37℃恒溫反應(yīng)15min。最后加入80μL 0.2mol/L 的Na2CO3溶液，于405nm 波長(zhǎng)下測(cè)OD 值。

以阿卡波糖(Acarbose)為陽性對(duì)照，同時(shí)設(shè)定對(duì)照組(緩沖液+ 酶液+ 底物)，空白組對(duì)照組(緩沖液)，樣品測(cè)定組(樣品+酶液+底物)，樣品對(duì)照組(樣品+ 緩沖液)，陽性對(duì)照組(Acarbose + 酶液+底物。

酶活性抑制率= {1- (A樣品- A樣品對(duì)照)/(A對(duì)照-A空白)}×100

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度和吸光度的線性關(guān)系，可以建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，并求出回歸方程。結(jié)果表明葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液在1.507～13.563μg/mL 內(nèi)呈良好線性關(guān)系(見圖1)。南方紅豆杉藥材中多糖的含量測(cè)定結(jié)果為1.75%。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取供試品溶液1.0mL 置于10mL 具塞試管中，取超純水1.0mL 作為空白對(duì)照，按“1.2.2.4”下方法測(cè)定，連續(xù)6 次測(cè)定的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，RSD 為1.71%，表明該方法具有良好的精確度(見表1)。

表1 精密度實(shí)驗(yàn)Table 1 Precision of the measured results

表2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)Table 2 Stability of the measured results

表3 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)Table 3 Reproducibility of the measured results

表4 加樣回收率實(shí)驗(yàn)Table 4 Recovery rate of the measured results

圖1 葡萄糖溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.1 Standard curve of glucose standard solution

2.2.2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密吸取供試品溶液1.0mL 置于10mL 具塞試管中，取超純水1.0mL 作為空白對(duì)照，按“1.2.2.4”下方法測(cè)定，在反應(yīng)結(jié)束后0、5、10、15、30、60、90、120min 測(cè)定的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，供試品溶液在2h 之內(nèi)保持穩(wěn)定(見表2)。

2.2.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 稱取同一批次干燥的南方紅豆杉枝葉5 份，按“1.2.2.3”和“1.2.2.4”下方法進(jìn)行操作，考察實(shí)驗(yàn)方法的重現(xiàn)性。結(jié)果顯示，RSD 為1.35%，表明該方法重現(xiàn)性較好(見表3)。

2.2.4 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密吸取供試品溶液0.4mL 置于10mL 具塞試管中，共9 份，依次加入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2、0.4、0.6mL，并添加水使終體積為1.0mL，取超純水1.0mL 作為空白對(duì)照，按“1.2.2.4”下方法測(cè)定，考察加樣回收率。結(jié)果顯示，平均加樣回收率為97.54%，RSD 為1.60%(表4)，表明該方法具有良好的準(zhǔn)確度。

2.3 南方紅豆杉粗多糖的體外降血糖活性

2.3.1 南方紅豆杉粗多糖對(duì)胰島素抵抗HepG2 細(xì)胞葡萄糖消耗的影響 南方紅豆杉粗多糖對(duì)胰島素抵抗HepG2 細(xì)胞葡萄糖消耗的影響見表5。

從表5 數(shù)據(jù)得出，南方紅豆杉粗多糖對(duì)胰島素抵抗HepG2 細(xì)胞的葡萄糖消耗具有促進(jìn)作用，當(dāng)給藥濃度為0.05mg/mL 時(shí)，效果最佳。同時(shí)，MTT 結(jié)果顯示，所設(shè)的給藥劑量對(duì)HepG2 細(xì)胞均具有不同程度的抑制作用，即表示南方紅豆杉粗多糖能促進(jìn)胰島素抵抗HepG2 細(xì)胞的葡萄糖消耗并非由于其促進(jìn)細(xì)胞增殖引起的，在扣除MTT 影響時(shí)，南方紅豆杉粗多糖仍表現(xiàn)出較好的促進(jìn)糖消耗作用。

同時(shí)表中數(shù)據(jù)還顯示，建立胰島素抵抗模型后細(xì)胞有增殖，MTT 值大于正?？瞻捉M。而生理胰島素的加入則會(huì)促進(jìn)細(xì)胞的輕度增殖，扣除MTT 影響后發(fā)現(xiàn)，南方紅豆杉粗多糖與生理胰島素具有一定的協(xié)同作用。

2.3.2 南方紅豆杉粗多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性的影響 南方紅豆杉粗多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性的影響見表6。

表6 中的數(shù)據(jù)顯示，南方紅豆杉粗多糖抑制活性較好，抑制率明顯高于陽性對(duì)照藥物，且對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用具有劑量依賴性，對(duì)南方紅豆杉粗多糖開發(fā)成α-葡萄糖苷酶抑制劑具有實(shí)際的指導(dǎo)意義。

表5 南方紅豆杉粗多糖對(duì)胰島素抵抗HepG2 細(xì)胞葡萄糖消耗的影響Table 5 Effect of crude polysaccharides from Taxus chinensis var.mairei to the glucose consumption of insulin-resistance HepG2 cells

表6 南方紅豆杉粗多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性的影響Table 6 Effect of crude polysaccharides from Taxus chinensis var.mairei to inhibitory activity of alpha-glucosidase

3 討論

3.1 南方紅豆杉粗多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶具有抑制作用

α-葡萄糖苷酶抑制劑可以防治餐后高血糖癥和緩解高胰島素血癥，同時(shí)可以提高糖耐量，具有十分廣闊的應(yīng)用前景?？喙嫌小八幱檬卟恕敝Q，現(xiàn)代研究表明苦瓜中皂苷［13-14］、多糖［15-16］可能是其發(fā)揮降糖作用的主要活性成分，苦瓜皂苷和多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶具有抑制活性，其IC50值分別為1.03mg/mL 和10.73mg/mL［17］。茶多糖也顯示較強(qiáng)的α-葡萄糖苷酶抑制活性，其α-葡萄糖苷酶IC50值為3.2 g/L［18］。與上述兩種植物比起來，南方紅豆杉粗多糖的IC50值為38.61mg/L 遠(yuǎn)優(yōu)于它們，說明南方紅豆杉粗多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性較高。

3.2 南方紅豆杉粗多糖對(duì)胰島素抵抗HepG2 細(xì)胞的葡萄糖消耗量具有促進(jìn)作用

在HepG2 細(xì)胞體外模型中，無論是否加入生理胰島素，南方紅豆杉粗多糖對(duì)胰島素抵抗HepG2 細(xì)胞的葡萄糖消耗量均具有促進(jìn)作用，加入生理胰島素后更具有協(xié)同加強(qiáng)作用。

4 結(jié)論

從兩種不同的體外降血糖模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以初步判斷南方紅豆杉粗多糖具有體外降血糖活性，但還存在一些不足，如胰島素抵抗模型的分子機(jī)制、降糖的機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。此外，南方紅豆杉粗多糖中成分比較復(fù)雜，含有多糖的同時(shí)還含有蛋白質(zhì)、氨基酸等等，對(duì)于除去蛋白質(zhì)后的精多糖降糖活性如何還有待下一步繼續(xù)研究，為后續(xù)的體內(nèi)降血糖實(shí)驗(yàn)和進(jìn)一步開發(fā)打下基礎(chǔ)。

［1］湖北省革命委員會(huì)衛(wèi)生局.湖北中草藥志［M］.湖北:湖北人民出版社，1978:473.

［2］謝志慧，杜玲玲，李效賢，等.南方紅豆杉研究新進(jìn)展［J］.中國(guó)藥業(yè)，2009，18(15):3-5.

［3］孔繁晟.云南紅豆杉枝葉中抗癌活性成分的提取工藝與黃酮類化合物的研究［D］.廣州:南方醫(yī)科大學(xué)，2007.

［4］李存芳，劉勇，董玫，等.南方紅豆杉化學(xué)成分的研究進(jìn)展［J］.中草藥，2007，38(8):1121-1132.

［5］嚴(yán)金龍，呂志敏.植物多糖的提取分離和應(yīng)用市場(chǎng)［J］.化工科技市場(chǎng)，2004，27(11):41-44.

［6］張錦雀，黃麗英，蘇聰枚.中草藥多糖提取分離純化研究進(jìn)展［J］.中藥材，2008，31(11):1760-1765.

［7］王玉華，袁久榮.中藥多糖的化學(xué)研究現(xiàn)狀［J］.中成藥，2009，26(6):496-498.

［8］Duo Zhang，Heng Meng，Hai-shan Yang.Antidiabetic activity of Taxus cuspidata polysaccharides in streptozotocin- induced diabetic mice ［J］ . International Journal of Biological Macromolecules，2011，50(2012):720-724.

［9］姜斐，姚楠，錢士輝，等.女貞子化學(xué)成分的提取分離鑒定與活性研究［D］.南京:南京中醫(yī)藥大學(xué)，2010.

［10］朱銀榮，肖雯，張繼.沙蒿多糖及其衍生物的體外降血糖活性研究［D］.蘭州:甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011.

［11］康文藝，張麗，宋艷麗.滇丁香中抑制α-葡萄糖苷酶活性成分研究［J］.中國(guó)中藥雜志，2009，34(4):406-409.

［12］陳百泉，李昌勤，常星，等.頭花蓼對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性研究［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2010，16(8):151-153.

［13］Nivitabishekam SN，Asad M，Prasad VS.Pharmacodynamic interaction of Momordica charantia with rosiglitazone in rats［J］.Chemico-Biological Interactions，2009，177(3):247-253.

［14］王先遠(yuǎn)，金宏，徐志勤，等.苦瓜皂甙降血糖作用及其機(jī)制初探［J］.氨基酸和生物資源，2001，23(3):42-45.

［15］徐斌，董英，張慧慧，等.苦瓜多糖對(duì)鏈脲佐菌素誘導(dǎo)糖尿病小鼠的降血糖效果［J］.營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，2006，28(5):401-408.

［16］Parichat B，Artiwan S.Extraction of phenolic compounds from fruits of Bitter Melon(Momordica charantia)with subcritical water extraction and antioxidant activities of these extracts［J］.Chiang Mai Journal Science，2008，35(1):123-130.

［17］王琪，鄧媛元，張名位，等.苦瓜皂苷和多糖的連續(xù)提取工藝及其對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用［J］.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，44(19):4058-4065.

［18］全吉淑，尹學(xué)哲，及川和志.茶多糖降糖作用機(jī)制［J］.中國(guó)公共衛(wèi)生，2007，23(3):295-296.