預(yù)處理對干燥羅非魚片蛋白質(zhì)變性的影響及優(yōu)化

鄭 曼，關(guān)志強 ，李 敏，吳寶川，康 彥

(廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點實驗室，廣東普通高等學(xué)校水產(chǎn)品深加工重點實驗室，廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東湛江524088)

羅非魚是我國當(dāng)前重要的淡水養(yǎng)殖品種之一，也是我國最具國際競爭實力、最具產(chǎn)業(yè)化發(fā)展前景的品種。因其肉質(zhì)鮮美、細嫩，含有豐富的蛋白質(zhì)和多種不飽和脂肪酸，日益受到人們的廣泛青睞。2009 年，我國羅非魚產(chǎn)量為125.7 萬t，占全球產(chǎn)量的三分之一以上［1-3］。羅非魚等水產(chǎn)原料大多含有較高的水分，生產(chǎn)季節(jié)性強，原料易于腐敗，必須采取有效手段對原料進行及時保鮮和加工處理。干燥是魚類保藏的常用技術(shù)，是許多食品加工中不可缺少的環(huán)節(jié)，也是一個復(fù)雜的工藝過程［4-5］。由于羅非魚魚肉含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪等營養(yǎng)成分，這些成分經(jīng)不同溫度的加熱處理后的變化情況不同，肌肉蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和化學(xué)性質(zhì)發(fā)生變化，嚴重影響了消費者的口感和對營養(yǎng)成分的需求［6-7］。關(guān)于水產(chǎn)品冷凍引起蛋白質(zhì)變性以及抗凍劑的研究，國內(nèi)外專家學(xué)者已做了不少值得借鑒的工作［8-10］，關(guān)于食品干燥前預(yù)處理方面的研究主要集中在果蔬類［11-14］，而魚類干燥過程蛋白質(zhì)的熱變性及品質(zhì)改良的研究卻鮮有報道。本文以大宗羅非魚為原料，采用熱泵干燥，以Ca2+-ATP 酶活性、鹽溶性蛋白溶解度和組織切片為指標(biāo)，研究了干燥預(yù)處理對干制羅非魚片蛋白質(zhì)變性作用的影響，為高品質(zhì)干燥羅非魚的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羅非魚 購于湛江市霞山海鮮市場。試劑 丙二醇，丙三醇，NaCl 均為食品級。

熱泵干燥裝置(自建)［15］;島津UV-1800 紫外分光光度計;DZF-6050 型真空干燥器:上海精宏實驗儀器有限公司;JA 2003A 型電子分析天平:上海精密科學(xué)儀器有限公司;YD2202 切片機，浙江省金華市益迪醫(yī)療設(shè)備廠;攝像顯微鏡，日本奧林巴斯出廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 工藝流程 原料魚→制取魚片→預(yù)處理→熱泵干燥→指標(biāo)檢測

1.2.2 操作要點 制取魚片:將新鮮的羅非魚去頭尾、去內(nèi)臟、去魚鱗后，清洗干凈，從魚脊骨上方開始取肉，兩側(cè)各取一片，去骨，然后對魚片進行去皮整形，控制魚片大小為50mm×40mm×4mm(±1mm)，約重15g。預(yù)處理:根據(jù)國家標(biāo)準GB 2760-2011 食品添加劑使用標(biāo)準確定丙二醇、丙三醇的添加量為1% ～5%。因此單因素實驗中在魚片表面分別添加丙二醇、丙三醇、NaCl 進行浸漬，添加量為1%，2%，3%，4%，5%，每小時攪拌1 次，浸漬3h。對照組不添加。在單因素實驗的基礎(chǔ)上，分別以丙二醇，丙三醇，NaCl 的添加量為自變量，以Ca2+-ATPase 活性為響應(yīng)值，進行響應(yīng)面實驗設(shè)計與分析。表1 為實驗設(shè)計水平編碼表。

表1 響應(yīng)面實驗因素和水平編碼表Table 1 Factors and the levels coding of experiment of response surface analys

熱泵干燥:用吸水紙吸取魚片表面水分，整齊地擺放在不銹鋼網(wǎng)上。在溫度分別為30、45、60℃，風(fēng)速2.5m/s，濕度28%～34%的條件下將魚片干燥至含水量為28%～30%。每個實驗重復(fù)3 次。

1.2.3 檢測方法

1.2.3.1 Ca2+-ATPase 活性的測定 采用ATP 酶檢測試劑盒測定。ATP 酶檢測試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。Ca2+-ATPase 活性以在25℃時每毫克蛋白質(zhì)在每小時內(nèi)所產(chǎn)生的無機磷的微摩爾數(shù)表示，單位為μmol Pi/mg prot/h。

式中:A1-干燥樣品魚肉的Ca2+-ATPase 活性;A2-新鮮魚肉的Ca2+-ATPase 活性。

1.2.3.2 鹽溶性蛋白的測定 準確稱取3g 魚肉充分研碎，用10 倍體積磷酸鹽緩沖液(I =0.05，pH7.5)提取1h，在4000r/min 下離心10min，去除上清液，重復(fù)兩次，沉淀肉用10 倍體積的Weber-Edsall 溶液(0.6mol/L KCl - 0.01mol/L Na2CO3- 0.04mol/L NaHCO3)在4℃的環(huán)境中提取20h，不斷攪拌，在6000r/min 下離心10min，取上清液，采用考馬斯亮藍法進行蛋白質(zhì)定量。

1.2.3.3 組織切片的觀察 采用Bouin 氏液對組織樣品進行固定，經(jīng)過梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，石蠟切片機切片，采用H.E 染色方法對組織切片進行染色，然后顯微影像10 ×10 倍放大攝影觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 預(yù)處理對干燥羅非魚片Ca2 +-ATPase 活性影響的單因素實驗

干燥過程中，由于蛋白質(zhì)分子與結(jié)合水的結(jié)合狀態(tài)被破壞，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，使魚肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase 活性下降，Ca2+-ATPase 活性大小能夠直接反映出肌球蛋白的變性程度，廣泛用來作為反映魚肉蛋白變性的指標(biāo)。由圖1 可知，在添加量小于4%的情況下，分別經(jīng)丙二醇、丙三醇和NaCl 浸漬得到的干制羅非魚片的Ca2+-ATPase 活性均高于對照組(添加量為零)，即能夠有效抑制魚肉蛋白在干燥過程中的熱變性。隨著預(yù)處理試劑添加量的增加，干燥羅非魚片Ca2+-ATPase 活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。丙二醇、丙三醇和NaCl 的添加量分別為3%、3%、1%時，干制羅非魚片的Ca2+-ATPase 活性達到最大值。因此在響應(yīng)面優(yōu)化實驗中預(yù)處理添加量的選取范圍取丙二醇2% ～4%，丙三醇2% ～4%，NaCl 0～1%。

圖1 45℃干燥條件下不同預(yù)處理對干燥羅非魚片Ca2+-ATPase 活性的影響Fig.1 Effect of different pretreatments on Ca2+-ATPase activity of tilapia fillets under 45℃

按照Box-Behnken 實驗方案進行三因素三水平實驗，結(jié)果見表2。將所得的數(shù)據(jù)用Design Expert 軟件最小二乘法擬合，得到預(yù)處理添加劑丙二醇(x1)、丙三醇(x2)和NaCl(x3)的二次多項回歸方程為:

2.2 預(yù)處理工藝模型建立及響應(yīng)面分析

由表3 方差分析可知，回歸方程的p ＜0.0001(極顯著)，由表3 可知失擬合p =0.1817(不顯著)，表明方程對實驗擬合良好，實驗誤差小。模型的總決定系數(shù)R2=0.9981，即有99.81%的正確性來表明響應(yīng)值的變化。利用此模型可以對預(yù)處理工藝對干燥羅非魚Ca2+-ATPase 活性的影響進行分析和預(yù)測。

該模型能較好地反映出丙二醇、丙三醇和NaCl的添加量與干燥羅非魚Ca2+-ATPase 活性的關(guān)系。由表3 可以看出，二次項x22、x32，交互項x1x3、x2x3，一次項x1、x3對干燥羅非魚Ca2+-ATPase 活性的影響顯著。圖4～圖6 分別顯示了x1x2、x1x3、x2x3的并互影響作用，圖形越陡等高線越密集，則交互作用越顯著，交互作用的排序為x2x3＞x1x3＞x1x2，這與方差分析中的結(jié)果一致。由響應(yīng)面模型得出最優(yōu)預(yù)處理工藝為:丙二醇2% +丙三醇3.01% +NaCl 0.95%，在該條件下干燥羅非魚 Ca2+- ATPase 活性為3.2331μmol Pi/mg prot/h。選取最佳條件:丙二醇2% +丙三醇3% +NaCl 1%，進行驗證性實驗，得到干燥羅非魚片的Ca2+-ATPase 活性為3.23μmol Pi/mg prot/h。

表2 羅非魚干燥預(yù)處理工藝響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Arrangement and result of response surface analysis about pretreatment condition

表3 羅非魚干燥預(yù)處理工藝響應(yīng)面實驗結(jié)果方差分析表Table 3 ANOVA for the pretreatment condition response surface mode

2.3 預(yù)處理對干制羅非魚片蛋白質(zhì)變性及組織結(jié)構(gòu)的影響

選取上述優(yōu)化后的預(yù)處理配方(丙二醇2% +丙三醇3% +NaCl 1%)，對羅非魚片進行干燥預(yù)處理，并與未經(jīng)預(yù)處理的對照組比較，分析預(yù)處理對干制羅非魚片蛋白質(zhì)變性及組織結(jié)構(gòu)的影響。

圖2 丙二醇和丙三醇響應(yīng)面立體分析Y=f(x1，x2)Fig.2 The response surface graph，Y=f(x1，x2)

圖3 丙二醇和NaCl 響應(yīng)面立體分析Y=f(x1，x3)Fig.3 The response surface graph，Y=f(x1，x3)

圖4 丙三醇和NaCl 響應(yīng)面立體分析圖，Y=f(x2，x3)Fig.4 The response surface graph，Y=f(x2，x3)

2.3.1 預(yù)處理對干制羅非魚片Ca2+-ATPase 活性的影響 由圖5 可知，三種干燥溫度下得到的羅非魚片Ca2+-ATPase 活性的變化率都在50%以上。干燥溫度對羅非魚片Ca2+-ATPase 活性有顯著影響，干燥溫度越高，干燥羅非魚的Ca2+-ATPase 活性越小。同一干燥溫度下，經(jīng)過預(yù)處理的羅非魚片Ca2+-ATPase 活性的下降受到很大程度的抑制，明顯高于空白對照組，干燥溫度為30、45、60℃時分別提高8.3%、13.5%和6.3%。

2.3.2 預(yù)處理對干制羅非魚片鹽溶性蛋白溶解度的影響 由圖6 可知，干燥溫度對羅非魚片的鹽溶性蛋白溶解度有顯著影響，干燥溫度越高，干燥羅非魚的鹽溶性蛋白溶解度越小。同一干燥溫度下，經(jīng)過預(yù)處理的羅非魚片鹽溶性蛋白溶解度明顯高于空白對照組，干燥溫度為30、45、60℃時分別提高19.4%、11.5%和10.6%。表明預(yù)處理可提高鹽溶性蛋白的溶解度，有效改善魚片的干制品質(zhì)。

2.3.3 預(yù)處理對干制羅非魚片組織結(jié)構(gòu)的影響 將新鮮羅非魚片樣品和經(jīng)過預(yù)處理試劑預(yù)處理后并在不同干燥溫度條件下干制的樣品進行組織切片分析，其結(jié)果如圖7～圖10 所示。

圖5 預(yù)處理對羅非魚片Ca2+-ATPase 活性的影響Fig.5 Effect of pretreatment on Ca2+-ATPase activity of tilapia fillets

圖6 預(yù)處理對羅非魚片鹽溶性蛋白溶解度的影響Fig.6 Effect of pretreatment on salt-solubility of myofibrillar protein of tilapia fillets

圖7 新鮮羅非魚縱、橫切片F(xiàn)ig.7 The vertical and across cutting film of fresh tilapia

由圖7 可以看出，新鮮魚片由于含水率較高，肌肉組織結(jié)構(gòu)清晰，排列有序，肌肉細胞完整性保持良好。圖8、圖9 和圖10 與圖7 對比可以看出，干制后其組織結(jié)構(gòu)發(fā)生了很大的變化，且與無添加相比，添加預(yù)處理試劑后魚片的組織結(jié)構(gòu)能得到有效的改善。

圖8 30℃干燥羅非魚縱、橫切片F(xiàn)ig.8 The vertical and across cutting film of tilapia dried under 30℃

根據(jù)細胞生物學(xué)的概念，細胞結(jié)構(gòu)的破壞會導(dǎo)致細胞液的大量流失，使維持細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的因素被破壞，這就極易導(dǎo)致酶活性的下降和肌球蛋白的變性。由圖7～圖10 比較可以看出，干燥魚片和新鮮魚片的組織結(jié)構(gòu)有明顯的差異。不論是否經(jīng)過預(yù)處理，干燥溫度高低，羅非魚的肌肉組織結(jié)構(gòu)都遭到了破壞。表現(xiàn)為:肌細胞的間隙減小，細胞受到機械損傷發(fā)生破裂，肌纖維擠壓在一起，使纖維結(jié)構(gòu)排列無序化;肌纖維發(fā)生局部斷裂，呈現(xiàn)收縮致密的結(jié)構(gòu)特征［16］。干燥溫度越高，魚片細胞和纖維組織破壞程度越嚴重。30℃得到的干制魚片組織結(jié)構(gòu)紋理清晰，排列整齊，變形程度小。而60℃得到的干制魚片組織結(jié)構(gòu)破壞嚴重，細胞間隙已連成塊甚至連成片，說明部分細胞已破壞，肌細胞基本上沒有完整的形態(tài)。同一干燥溫度下，經(jīng)預(yù)處理的魚片組織結(jié)構(gòu)相對清晰，排列整齊，變形程度小。說明預(yù)處理能有效減少魚片組織結(jié)構(gòu)的變形，改善干品品質(zhì)。

圖9 45℃干燥羅非魚縱、橫切片F(xiàn)ig.9 The vertical and across cutting film of tilapia dried under 45℃

3 結(jié)論

3.1 以Ca2+-ATPase 活性為指標(biāo)，利用響應(yīng)面優(yōu)化分析得到最佳預(yù)處理工藝:丙二醇2% +丙三醇3%+NaCl 1%，此預(yù)處理條件下得到的干燥羅非魚片Ca2+-ATPase 活性為3.23μmol Pi/mgprot/hour。

3.2 干燥溫度對羅非魚片的Ca2+-ATPase 活性、鹽溶性蛋白溶解度及組織結(jié)構(gòu)有顯著影響，干燥溫度越高，魚片Ca2+-ATPase 活性和鹽溶性蛋白溶解度越小，組織結(jié)構(gòu)破壞程度越嚴重。

圖10 60℃干燥羅非魚縱、橫切片F(xiàn)ig.10 The vertical and across cutting film of tilapia dried under 60℃

3.3 預(yù)處理能有效防止魚片干燥過程的蛋白質(zhì)變性，明顯減少肌肉組織的機械損傷，有效保護細胞的完整性和肌纖維排列的有序性。使用預(yù)處理劑處理魚片，能防止魚片蛋白質(zhì)變性，有效改善干魚片品質(zhì)。

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