陜西苦菜葉總黃酮的提取及抗氧化活性的測定

周勸娥，田呈瑞 ，關 為，張增帥，馬婷婷

(陜西師范大學食品工程與營養(yǎng)科學學院，陜西西安710062)

醫(yī)學研究表明，黃酮類化合物具有抗氧化、降血糖、降血脂、抗腫瘤、抗菌、抗病毒等作用［1-3］，在醫(yī)藥、化妝品及食品工業(yè)中被廣泛應用［4-6］。從20 世紀80 年代人們就利用黃酮類化合物研發(fā)出抗心血管病藥物、止咳平喘藥等，臨床上用來治療冠心病、心絞痛、腦血管疾病、腦動脈硬化、高血壓、心肌梗塞等疾?。?-9］?？嗖?，學名敗醬草(Patrinia villosa(Thunb.)Juss)，為敗醬科植物。是一種常用的草藥，多野生于山坡、荒路、田邊?？嗖朔植紭O廣，幾乎全國各地都有生長［10］，可采摘其嫩苗或嫩葉洗凈做涼拌菜或做餡食用，味道鮮美可口。盧新華［11］和李美化［12］等的實驗證明，苦菜有明顯的抗氧化作用;韓陽陽［13］等研究了苦菜不同部位提取物的抗氧化活性，表明苦菜提取物的抗氧化活性與其總黃酮和總多酚的含量有關，其不同部位的抗氧化能力大小為:花＞葉＞莖＞根;孟良玉［14］等的研究顯示，敗醬草黃酮提取物在各抗氧化體系中抗氧化活性均強于VC。目前，對苦菜的研究主要集中在其粗提物活性的研究上，對其黃酮類成分的提取工藝及其優(yōu)化研究較少?？嗖说目寡趸钚砸蚱洚a地的不同差異較大，本文針對陜西野生苦菜葉總黃酮的超聲波輔助提取進行了優(yōu)化，并對提取物的抗氧化活性進行了研究，以期為陜西野生苦菜的進一步開發(fā)和合理高效利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮苦菜 由榆林市東方紅有限責任公司提供，采自于陜西省榆林市佳縣山區(qū)，采摘日期為9 月15 日;蘆丁標準品，生化試劑 西安惠豐生化集團股份;無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、三氯化鐵、三氯乙酸、氯仿、鐵氰化鉀、二氯化亞鐵、水楊酸、雙氧水等均為分析純 西安化學試劑廠;DPPH 自由基 美國Sigma 公司。

722 型可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司;RE-52A 型旋轉蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠;LAC164 型電子分析天平(精確至0.0001g) 梅特勒—托利多(上海)儀器有限公司;FW100 型高速萬能植物粉碎機天津市泰斯特儀器有限公司;KQ-600DB型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;GZX-9146MBE 數(shù)顯鼓風干燥箱 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠;其他均為實驗室常用設備與儀器。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品處理 新鮮苦菜→攤涼→去除雜物→洗凈→曬至半干→烘箱內50℃烘干→植物粉碎機粉碎→過60 目篩→密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 標準曲線的制備

1.2.2.1 蘆丁標準溶液的配制 精確稱取蘆丁標準品0.0100g，置于100mL 容量瓶中，用70%乙醇溶解，稀釋至刻度，搖勻，即可得濃度為0.1mg/mL 蘆丁標準溶液。

1.2.2.2 標準曲線的制作［15］精確吸取標準溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL 分別置于6 個10mL 試管中，用30%的乙醇補足至5.0mL。再加入0.3mL 5%的亞硝酸溶液，搖勻，靜置6min。精確加入0.3mL 10%的硝酸鋁溶液，搖勻，靜置6min。再加入4.0mL 4%的氫氧化鈉溶液，用蒸餾水定容。放置15min，在波長510nm 處測定吸光度，繪制標準曲線。

1.2.3 樣品總黃酮含量的測定 準確稱取2.000g 苦菜粉，按實驗方案進行超聲波輔助提取，提取液過濾，取上清液，用70%的乙醇定容50mL。取1.0mL樣品黃酮提取液，按照1.2.2.2 的方法測定其在510nm 處的吸光度。根據(jù)標準曲線計算提取液中總黃酮含量?？傸S酮提取含量為1g 原料中總黃酮的質量(mg)。

式中:Y 為總黃酮提取含量(mg/g);C 為由標準曲線計算得出的樣品液的總黃酮質量濃度(mg/mL);V 為樣品液的體積(mL);m 為苦菜粉末質量(g);D 為稀釋倍數(shù)。

1.2.4 單因素實驗 在超聲功率和超聲頻率分別為200W 和80Hz 的條件下研究超聲溫度、料液比、乙醇濃度和超聲時間對總黃酮提取含量的影響，其中:料液比采用1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40 六個水平、超聲溫度采用40、50、60、70、80℃五個水平、超聲時間采用10、20、30、40、50min 五個水平、乙醇體積分數(shù)采用50%、60%、70%、80%、90%五個水平分別進行單因素實驗。

1.2.5 正交實驗 選L9(34)作正交實驗，以總黃酮的提取含量為指標確定其最佳工藝參數(shù)。具體實驗設計如表1 所示。

表1 正交實驗設計Table 1 The design of orthogonal test method

1.2.6 抗氧化活性的測定

1.2.6.1 清除DPPH 自由基能力的測定參照Brandwilliams 等［16］的方法，稍作修改測定苦菜葉提取液純化后對DPPH 自由基的清除能力。實驗測定之前，配制0.1mmol/L 的DPPH 乙醇溶液。用移液管分別吸取1.0mL 的不同濃度黃酮樣品水溶液和3.0mL 剛配制的DPPH 溶液于試管中，混合均勻，無光反應30min，于517nm 處測定其吸光度，記錄數(shù)據(jù)。用等體積的蒸餾水代替黃酮樣品液作空白對照，用來測定乙醇溶液中未反應之前DPPH 的吸光度。用與樣品溶液同濃度的抗壞血酸溶液和BHT 溶液作為陽性對照。以樣品液濃度為橫坐標，自由基清除率為縱坐標作圖分析樣品的自由基清除能力。每次實驗重復三次。對DPPH 自由基的清楚能力按以下公式計算:

其中:I 表示對自由基的清除率，%;Ai表示樣品溶液和DPPH 溶液混合液的吸光度(1mL 樣品溶液+3mL 的DPPH 溶液);Aj表示未加DPPH 溶液的樣品溶液的吸光度(1mL 樣品溶液+ 3mL 的乙醇溶液);A0表示未加樣品時DPPH 溶液的吸光度(1mL乙醇溶液+3mL 的DPPH 溶液)。

1.2.6.2 還原能力的測定 樣品提取液還原能力的測定按照稍作修改的Vaquero 等［17］的方法進行。具體的操作步驟是:取2.5mL 的樣品提取液(樣品濃度的變化范圍是0.1 ～1.0mg/mL)加入到裝有2.5mL 0.2mol/L pH6.6 的磷酸緩沖液的試管中，再加入2.5mL 1% 的鐵氰化鉀溶液混合均勻。50℃反應20min 后，加入2.5mL 10%的三氯乙酸在3000r/min的轉速下離心10min，取上清液5mL 與4mL 的蒸餾水和0.5mL 0.1%的三氯化鐵溶液混合。反應10min后，在700nm 處測其吸光度?；旌弦旱奈舛仍礁弑硎緲悠诽崛∫旱倪€原能力越強。

1.2.6.3 清除羥基自由基能力的測定 按照Yan等［18］描述的方法測定樣品提取液對羥基自由基的清除能力。將2mL 的樣品溶液與2mL 2mmol/L 的二氯化鐵、2mL 2mmol/L 的過氧化氫溶液和2mL 6mmol/L的水楊酸混合，再加入10mL 的蒸餾水，在37℃的水浴鍋中反應30min。在510nm 處設置空白對照測其吸光值。陽性對照為抗壞血酸和BHT。以樣品濃度為橫坐標，清除率為縱坐標作圖分析對羥基自由基的清除能力。每次實驗重復三次。清除率(SA)按以下公式計算:

其中:A0表示未加樣品混合液的吸光度(2mL 的二氯化鐵+2mL 過氧化氫+2mL 水楊酸);Ai表示樣品的吸光度(2mL 的二氯化鐵+2mL 過氧化氫+2mL水楊酸+2mL 的樣品溶液);Aj未加過氧化氫溶液樣品的吸光度(2mL 的二氯化鐵+2mL 水楊酸+2mL的樣品溶液);SA 為樣品對羥基自由基的清除率，%。1.2.6.4 清除超氧陰離子自由基能力的測定 根據(jù)稍作修改的Marklund 等［19］的方法測定樣品提取液清除超氧陰離子的能力。取4.5mL 0.05mol/L Tris-HCL(pH8.2)的緩沖液，在25℃的水浴鍋中預熱20min，然后加入1mL 的樣品溶液(濃度變化范圍是0.1 ～0.7mg/mL)和0.4mL 0.025mol/L 鄰苯三酚溶液混合均勻。將混合液置于25℃的水浴鍋中反應4min。加入1.0mL 8mmol/L 的鹽酸溶液終止反應。設置空白對照于320nm 處測定混合液的吸光度?？箟难岷虰HT 用作陽性對照。每次實驗重復三次。樣品液清除超氧陰離子的能力按以下公式計算:

其中:I 表示清除率，%;A0表示未加樣品混合液的吸光度;Ai表示測試樣品的吸光度;Aj表示不含水楊酸混合液的吸光度。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 使用Excel 與DPSv7.05 數(shù)據(jù)處理軟件對實驗數(shù)據(jù)的方差顯著性進行分析。

2 結果與分析

2.1 蘆丁標準曲線繪制

按照1.2.2.2 的方法繪制的標準曲線如圖1所示。

圖1 蘆丁標準曲線Fig.1 The standard curve of rutin

由圖1 可以得到標準曲線的回歸方程為A =0.0119C-0.0036，R2=0.9995。蘆丁在0～50mg/L濃度范圍內與吸光度線性良好。

2.2 溫度對提取含量的影響

由圖2 可知，溫度對苦菜總黃酮的提取含量呈先上升后下降趨勢，在60℃達到最大值，此時超聲波輔助提取總黃酮的含量是43.4mg/g。這可能是因為在一定濃度范圍內，溫度的升高有利于黃酮的溶出;當高于某一值時，繼續(xù)升高溫度會導致水溶性黃酮的水解進而使其提取含量下降;另外，也可能由于黃酮本身具有還原性，高溫會使黃酮變性［20］。

圖2 超聲溫度對提取效果的影響Fig.2 Effect of ultrasonic temperature on extraction

2.3 料液比對提取含量的影響

由圖3 可知，料液比對總黃酮的提取含量影響明顯，隨著溶劑用量的增加先上升后下降，究其原因可能是料液比影響了溶劑的極性，使樣品中不同極性的黃酮類化合物溶出率不同;當料液比繼續(xù)增大時，可能出現(xiàn)樣品過飽和現(xiàn)象，導致提取率降低［20］。超聲波輔助提取中，料液比為1∶30 時，總黃酮的提取含量最高，為34.44mg/g。

圖3 料液比對提取效果的影響Fig.3 Effect of solid to liquid ratio on extraction

2.4 乙醇體積濃度對提取含量的影響

由圖4 可知，總黃酮提取含量隨乙醇濃度的增加先上升后下降，原因可能是隨著乙醇濃度的增加，樣品溶液極性變弱，導致樣品中極性相對較大的黃酮類化合物溶出率下降，極性小的溶出率上升，而樣品中極性不同的黃酮類化合物含量不同［20］。超聲波輔助提取中，乙醇濃度為60%時，總黃酮的提取含量最高，為43.83mg/g。

圖4 乙醇濃度對提取效果的影響Fig.4 Effect of ethanol concentration on yield of total flavonoids

2.5 時間對提取含量的影響

由圖5 可知，隨著處理時間的延長，總黃酮的提取含量呈上升趨勢，40min 時達到最大值46.98mg/g。提取時間增大有助于黃酮類化合物的溶出，但當達到一定的時間時出現(xiàn)稍微下降的趨勢，可能是由于黃酮類化合物分解所造成的［20］。

2.6 正交實驗結果與分析

2.6.1 超聲波輔助提取正交實驗 選取超聲時間、超聲溫度、料液比和乙醇體積分數(shù)進行4 因素3 水平正交實驗，實驗結果如表2 所示。對實驗結果進行方差分析，其結果見表3。

表2 正交實驗結果Table 2 The results of orthogonal test method

由表2 極值可知，各因素影響的主次順序為超聲溫度＞乙醇濃度＞料液比＞超聲時間。

方差分析結果表明，超聲溫度、乙醇濃度、料液比和超聲時間對苦菜總黃酮的提取含量影響均極顯著。根據(jù)分析得出優(yōu)化最佳提取工藝為A3B2C3D2，即乙醇濃度為80%、溫度為70℃、料液比為1∶35、超聲時間為40min。

2.6.2 驗證實驗 按照正交實驗獲得的最優(yōu)組合:溫度70℃、乙醇體積濃度80%、料液比1∶35、提取時間40min，進行超聲波輔助提取實驗，其總黃酮的平均含量是64.62mg/g，比正交實驗表中第5 號實驗組合B2A2C3D1的黃酮含量64.10mg/g 高。

2.7 苦菜葉黃酮的抗氧化能力

2.7.1 清除DPPH 自由基的能力 不同質量濃度的樣品和陽性對照清除DPPH 自由基能力如圖6 所示。DPPH 自由基是一種被廣泛使用的用來測定生物材料抗氧化活性的穩(wěn)定的色原物質［21］。在清除DPPH自由基實驗中，抗氧化劑對DPPH 自由基的清除能力表現(xiàn)為它們提供氫質子的能力［22］。從圖6 中可以看出，隨著樣品質量濃度的增加(由0.1～0.7mg/mL)，DPPH 自由基的清除率從68.6%增加到93.6%。與同等質量濃度的抗壞血酸和BHT 相比較，樣品的清除率稍微高于BHT 的清除率，但低于抗壞血酸的清除率。在實驗濃度范圍內，抗壞血酸對自由基的清除率在92.4%～98.1%范圍內。

圖6 提取液、BHT 和抗壞血酸對DPPH 自由基的清除效果Fig.6 Scavenging effect of sample，BHT and VC on DPPH radical

2.7.2 提取物的還原能力 樣品提取物、抗壞血酸和BHT 的還原能力如圖7 所示。從圖中可以看到，隨著質量濃度的增加，其還原力也隨之在增加。然而，與抗壞血酸和樣品相比，BHT 顯示出了低還原能力。當質量濃度達到0.9mg/mL 時，樣品提取物的還原能力明顯高于抗壞血酸在此濃度下的還原能力。還原能力的測定中，樣品中黃酮類化合物的存在使得鐵氰化物中的三價鐵變成以Fe2+存在的復雜化合物。根據(jù)文獻［23-24］的研究報道，測定黃酮類物質的還原能力對解釋說明它們的抗氧化效果和還原能力之間的關系是必要的。提取物中的黃酮類化合物是良好的電子供體，能夠通過使自由基轉化成更穩(wěn)定的產物而使自由基反應鏈終止。

表3 方差分析結果Table 3 The results of variance analysis

圖7 樣品、BHT 和抗壞血酸的還原能力Fig.7 Reducing power of sample，BHT and VC

2.7.3 清除羥基自由基的測定 樣品提取物以及用作陽性對照的抗壞血酸和BHT 對羥基自由基的清除能力如圖8 所示。從圖中可知:提取物和陽性對照品的抗氧化活性隨著濃度的增加而提高。當提取物的濃度由0.1mg/mL 增加至0.9mg/mL 時，其對羥基自由基的清除率由9%上升到80%，顯著高于BHT對羥基自由基的清除率。由圖也可知，提取對羥基自由基有較高的清除能力。作為最有反應活性的自由基，羥基自由基能夠與活細胞中具有生物功能的幾乎所有的生物大分子反應［25］。羥基自由基能夠通過Fe2+和H2O2的反應而產生，而黃酮類化合物能夠螯合Fe2+。因此，黃酮類化合物能夠通過螯合Fe2+減少羥基自由基的產生。

圖8 對羥基自由基的清除效果Fig.8 Scavenging effect on hydroxyl free radical

2.7.4 清除超氧陰離子的能力 圖9 所示為樣品提取物、抗壞血酸和BHT 對超氧陰離子的清除效果。從圖中可知，提取物對超氧陰離子的清除率隨著樣品濃度的增加而升高。當樣品濃度為0.7mg/mL 時，提取物對超氧陰離子的清除率為67%，高于此濃度下BHT 的清除率(51.8%)。黃酮類化合物含有鄰位羥基能夠提供活性氫質子參與以下清除超氧陰離子的反應:

超氧化物歧化酶通過催化作用參與上述反應，并通過提供氫質子作為一種抗氧化劑［26］。擁有較低氧化還原電勢(0.23V ＜E7＜0.75V)的黃酮類化合物熱力學上能夠通過提供氫原子降低氧化還原電勢在2.13～1.0V 范圍內的活性氧自由基如超氧陰離子、過氧化氫、羥基自由基和烷氧基自由基的電勢。

圖9 對超氧陰離子的清除效果Fig.9 Scavenging effect on superoxide free radical

3 結論

3.1 在超聲波輔助提取方法中，溫度、時間、乙醇體積分數(shù)和料液比對苦菜黃酮的提取含量均影響顯著。超聲波輔助提取的最佳工藝條件是乙醇濃度為80%、溫度為70℃、料液比為1 ∶35、超聲時間為40min。此時苦菜黃酮的提取含量是64.62mg/g。

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