甘油與氯化鈉模型熱反應中生成3-氯-1，2-丙二醇的研究

張 岱，孫培培，黃明泉 ，孫寶國，鄒青青

(北京工商大學，北京市食品風味化學重點實驗室，食品添加劑與配料北京高校工程研究中心，北京100048)

氯丙醇是甘油(丙三醇)結(jié)構(gòu)上的羥基被氯原子取代的一類化合物，包括3 - 氯- 1，2 - 丙二醇(3-MCPD)、2-氯-1，3-丙二醇(2-MCPD)、1，3-二氯-2-丙醇(1，3-DCP)和2，3-二氯-1-丙醇(2，3-DCP)［1］。其中，3-氯-1，2-丙二醇是氯丙醇類化合物中常見的代表物質(zhì)，具有很強的毒性。目前的研究已初步證明3-MCPD 可以使染色體發(fā)生畸變［2-3］。同時，Haratake J 等研究發(fā)現(xiàn)，3-MCPD 能減少精子數(shù)、降低精子活性，使雄性動物生殖能力減弱［4］。另外，小鼠口服3-MCPD 會引發(fā)部分器官產(chǎn)生良性腫瘤［5］。氯丙醇也是目前公認的食品污染物之一，它主要存在于鹽酸水解植物蛋白(HVP)加工而成的醬油等調(diào)味汁中。此外，氯丙醇污染還擴大到其它食品中，包括餅干、面包和肉制品［6-8］。張明霞［9-10］等在對膨化食品檢測中發(fā)現(xiàn)，所測膨化食品中均含有氯丙醇類化合物。食品中氯丙醇的來源主要有兩種途徑:一是外源性污染，如包裝材料的污染、食品原料的引入;二是食品在制造過程中生成，如醬油、蠔油等調(diào)味品在加工過程中，油脂的水解產(chǎn)物會與氯化物反應生成氯丙醇［11］，主要是含HVP 的配制醬油中氯丙醇污染最為嚴重［12-15］。為了控制食品中氯丙醇的含量水平，減少其對身體健康的危害，人們對食品中氯丙醇的形成機理和影響因素進行了研究。Pavel等［16］以NaCl、甘油、大豆卵磷脂和三油酸甘油酯三者組成的混合物建立模型熱反應，發(fā)現(xiàn)3-MCPD 的形成主要依賴于NaCl 的濃度。Colin 等［17］考察了面粉、鹽、水三者混合后發(fā)酵產(chǎn)物中氯丙醇的形成因素，發(fā)現(xiàn)3-MCPD 的形成受溫度、濕度等外界條件的影響。HAMLET 等［18］向面團中加入葡萄糖，模擬烘焙食品中氯丙醇的形成動力學模型，發(fā)現(xiàn)葡萄糖能使3-MCPD的含量增加。目前對熱反應香精中氯丙醇的形成機理和影響因素尚未見報道。為了研究熱反應香精制備過程中油脂與氯化鈉反應生成氯丙醇的過程和影響因素，本研究以甘油、氯化鈉和水建立了熱反應模型，利用正交實驗，考察了各個因素(時間、溫度、NaCl 和甘油用量)對3-MCPD 生成量的影響，同時也考察了單糖和氨基酸對3-MCPD 生成的影響，旨在探討3-MCPD 生成機理及其影響因素，控制食品中氯丙醇的含量水平，減少其對身體健康的危害。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

正己烷、無水乙醚、無水硫酸鈉 均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司;硅藻土 化學純，北京化學試劑公司;七氟丁?；溥?衍生化試劑，上海梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司。

1mL 氣密針 Agilent 公司;KH-500DE 型數(shù)控超聲波清洗器 昆山超聲儀器有限公司;EYELA N-1001型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海愛朗儀器有限公司;N-EVAP型干浴氮吹儀 上海思伯明儀器設(shè)備有限公司;TRACE ULTRA-DSQⅡ型氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Thermo Fisher 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 3- MCPD 形成條件正交實驗設(shè)計影響3-MCPD反應的關(guān)鍵因素通常包括反應時間、反應溫度和反應物的用量，因此本實驗對于時間、溫度、甘油和氯化鈉用量組成的模型體系的反應［19-21］，通過正交實驗考察上述4 個因素對3-MCPD 形成的影響。

Breitling-Utzmann［19］等曾向面團中按照相應比例添加不同成分，如:油脂、鹽、乳化劑、糖等，然后在各個溫度下進行烘焙，考察3-MCPD 的生成情況;Hamlet［20］等研究了面團模型體系中甘油、氯化物分別在0～2.4%、0～2.5%濃度范圍內(nèi)對3-MCPD 形成的影響;SVEJKOVSKá［21］等模擬食品實際加工過程，測定各種因素(豆油量、氯化鈉含量、水分含量和溫度)對3-MCPD 產(chǎn)量的影響。綜合以上研究結(jié)果，同時排除誤差干擾、避免甘油和NaCl 用量過低或過高等極端化條件，優(yōu)化實驗條件使其具有實際意義。本實驗確定了正交實驗中考察的4 個因素的水平(表1)，其中，甘油用量占物料總量≤1.0%、NaCl 用量占物料總量＜13.0%，水的用量固定值為15.0mL。

表1 不同條件下生成3-氯-1，2-丙二醇的正交實驗因素水平表Table 1 Factors and levels in orthogonal array design for thermal reaction of 3-MCPD formation

1.2.2 不同種類單糖和氨基酸對3-MCPD 生成量的影響 為了更好地模擬食品加工過程中的實際熱反應，在正交實驗基礎(chǔ)上研究了常見單糖和氨基酸對3-MCPD形成的影響，選擇3-MCPD 生成量最多的熱反應條件進行實驗。根據(jù)實際熱反應中單糖和氨基酸的用量，向模型熱反應中分別加入占總質(zhì)量3.0%的5 種單糖:葡萄糖、果糖、木糖、半乳糖、甘露糖;以及占總質(zhì)量2.0%的17 種常見氨基酸:天冬氨酸、賴氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、絲氨酸、脯氨酸、谷氨酸、精氨酸、組氨酸、纈氨酸、色氨酸、甘氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、丙氨酸、酪氨酸。同時，做空白對照實驗，并計算收率。

3-MCPD 收率(%)=(加入單糖或氨基酸后生成量-空白實驗生成量)/空白實驗生成量×100

1.2.3 GC-MS 分析條件 色譜條件:Rtx-5 毛細管柱(30m ×0.25mm，0.25μm);進樣口溫度260℃;升溫程序:起始溫度50℃，保持1min，以2℃/min 程序升溫到90℃，再以40℃/min 升至280℃，保持5min;載氣(He)流速1.0mL/min，進樣量1.0μL;不分流進樣。

質(zhì)譜條件:電子轟擊(electron impact ion source，EI)離子源;電子能量70eV;傳輸線溫度250℃;離子源溫度 200℃;溶劑延遲12min;選擇離子掃描(SIM)，m/z 253、275、289、291 和453 作為3-MCPD定性鑒別離子，m/z 253 作為3-MCPD 定量分析離子。

1.2.4 3-MCPD 含量的測定 采用氣相色譜/質(zhì)譜法(GC/MS)測定3-MCPD 含量，參見國家標準《GB/T 5009.191-2006 食品中氯丙醇含量的測定》［22］。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘油與氯化鈉模型熱反應各因素對3-MCPD生成量的影響

在甘油與氯化鈉模型熱反應中，通過正交實驗考察了反應時間、溫度和各原料用量的影響，正交實驗結(jié)果見表2。

根據(jù)表2 中的K 值確定在A3B2C4D2條件下，生成3-MCPD最少;在A4B3C2D4條件下，3-MCPD 生成量最多，與表2 中實驗15 相對應，為0.852mg/kg。同時，在表2 中，在實驗8 條件下3-MCPD 的生成量最少，僅為0.005mg/kg，二者相差達170 倍之多。對正交表中實際測得3-MCPD 最小生成量條件(實驗8)與由K 值得出的最優(yōu)條件A3B2C4D2進行驗證。結(jié)果表明，實驗8 目的產(chǎn)物的生成量相比于A3B2C4D2較少。因此，實驗8(A2B4C3D2)為最適條件，即反應時間2h、反應溫度140℃、甘油用量0.05g(占原料總量0.31%)、NaCl 用量1.0g(6.23%)、水用量15g(93.46%)條件下，3-MCPD 生成量最少，確定為最優(yōu)條件。

表2 不同條件下3-氯-1，2-丙二醇生成量的正交實驗結(jié)果Table 2 The result of the orthogonal experiment of formation of 3-MCPD

各因素對3-MCPD 生成量影響的主次順序為時間＞甘油用量＞NaCl 用量＞反應溫度。其中，熱反應時間對生成量的影響作用最大，反應溫度作用最小。

2.2 不同種類單糖對3-MCPD 生成量的影響

單糖一般是多羥基醛或多羥基酮。其中，葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖均為醛糖，果糖是酮糖。為了考察糖類物質(zhì)對3-MCPD 生成量的影響，向熱反應最優(yōu)條件模型中，加入5 種單糖，并與空白實驗進行對照，結(jié)果見圖1。

如圖1 所示，加入5 種單糖后3-MCPD 的生成量均減少。其中，葡萄糖對3-MCPD 生成量的影響最小，果糖、木糖、甘露糖影響作用依次增強，半乳糖影響最為明顯。其原因可能是在高溫條件下糖的醛基或酮基可以與3-MCPD 發(fā)生縮合反應，從而減少3-MCPD的生成量(如圖2、圖3)［23］。此外，單糖自身可發(fā)生裂解，生成含有3 個碳原子的醛或酮，如甘油醛，再與3-MCPD 發(fā)生縮合反應而降低3-MCPD 的含量。

2.3 不同種類氨基酸對3-MCPD 生成量的影響

圖1 不同糖類物質(zhì)對3-MCPD 收率的影響Fig.1 Yield of 3-MCPD influenced by different carbohydrates

圖2 3-MCPD 與醛糖反應方程式Fig.2 3-MCPD and aldose reaction equation

圖3 3-MCPD 與酮糖反應方程式Fig.3 3-MCPD and ketose reaction equation

在最優(yōu)條件下，加入17 種不同種類氨基酸，與空白實驗進行對照，考察了氨基酸對3-MCPD 生成的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 常見氨基酸對3-MCPD 收率的影響Fig.4 Influence of common amino acids on the yield of 3-MCPD

如圖4 所示，谷氨酸、蛋氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、甘氨酸使3-MCPD 的生成量增加;纈氨酸、精氨酸、賴氨酸、絲氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、組氨酸減少3-MCPD 的生成量;半胱氨酸、酪氨酸、脯氨酸、色氨酸對3-MCPD 的生成無明顯作用。

在熱反應模型中加入氨基酸后，會與生成的3-MCPD發(fā)生化學反應，其中以酯化反應最為常見。由于氨基酸種類多樣，物理化學性質(zhì)不同，因此不同氨基酸與3-MCPD 發(fā)生的反應存在差異。

在甘油通過一氯取代生成3-MCPD 的親核取代反應中，酸性條件可促進反應，但介質(zhì)酸性類型和酸度高低對反應的影響程度不同［24-25］。天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、蛋氨酸的等電點pI ＜7，在中性溶液中水解顯酸性，故利于3-MCPD 的生成，因此3-MCPD的生成量增加。其中，谷氨酸酸性較強，蛋氨酸溶解度較大，故二者對3-MCPD 的生成量影響較為明顯。賴氨酸、精氨酸、組氨酸屬于堿性氨基酸，等電點pI ＞7，在中性溶液中水解顯堿性，羥基會取代氯離子生成甘油，故不利于3-MCPD 的生成。

纈氨酸、亮氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、苯丙氨酸以與3-MCPD 發(fā)生酯化反應為主(見圖5)［26］，從而使3-MCPD的生成量減少。

圖5 3-MCPD 與氨基酸發(fā)生酯化反應方程式Fig.5 Esterification reaction equation of 3-MCPD and amino acid

3 結(jié)論

3.1 通過正交實驗，經(jīng)過GC-MS 分析得出了最優(yōu)條件，即在反應時間2h，溫度140℃，甘油用量0.05g(占原料總量0.31%)、NaCl 用量1.0g(6.23%)、水用量15g(93.46%)條件下3-MCPD 生成量最少。其中，影響3-MCPD 生成量的首要因素是時間，甘油用量是較重要因素，NaCl 用量是次要因素，反應溫度對3-MCPD 生成量的影響作用最小。在實際熱反應中可以對各個影響因素進行相應的調(diào)整和控制，以減少食品加工過程中3-MCPD 的形成。

3.2 由于不同物質(zhì)在物理化學性質(zhì)上存在差異，與3-MCPD 發(fā)生的反應不同，因此對3-MCPD 生成量的影響不同。結(jié)果表明:葡萄糖、果糖、木糖、甘露糖、半乳糖、纈氨酸、精氨酸、賴氨酸、絲氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、組氨酸使3-MCPD 的生成量減少;谷氨酸、蛋氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、甘氨酸使3-MCPD的生成量增加;半胱氨酸、酪氨酸、脯氨酸、色氨酸對3-MCPD 的生成無明顯作用。

3.3 本實驗就各個因素對3-MCPD 形成的影響作用進行了初步探討，但是對于實際熱反應中3-MCPD的形成機理和具體產(chǎn)物還需深入研究。

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