瑞士乳桿菌AJT 所產(chǎn)抗菌物質(zhì)的初步研究

趙 娜，薩如拉，郭 軍，烏云達(dá)來

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特010018)

乳酸菌既能賦予產(chǎn)品優(yōu)良的感官性質(zhì)，增加發(fā)酵食品的安全性，又能部分抑制原材料中腐敗微生物和致病菌的生長［1］，產(chǎn)生具有抑菌或殺菌效果的有機(jī)酸、過氧化氫、雙乙酰和細(xì)菌素等［2］。細(xì)菌素是細(xì)菌產(chǎn)生的一種抗菌物質(zhì)，它是在代謝過程中通過核糖體合成機(jī)制產(chǎn)生的一類具有抗菌活性的多肽或前體多肽，抗菌對象主要是產(chǎn)生菌分類上相近的細(xì)菌［3-4］。近幾十年，已經(jīng)從乳桿菌中分離出十幾種細(xì)菌素，而且不斷有新的乳桿菌素被分離出來［5］，如植物乳桿菌細(xì)菌素BacTN635［6］、嗜酸乳桿菌細(xì)菌素TS1［7］等。隨著研究的深入，人們把陸續(xù)發(fā)現(xiàn)的一些不符合或不完全符合細(xì)菌素定義的拮抗物質(zhì)稱為類細(xì)菌素［8-9］。類細(xì)菌素對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、真菌等都具有抑制作用［10］，其抗菌譜比細(xì)菌素更廣，這一特性決定了它具有比細(xì)菌素更廣泛的應(yīng)用前景［11］。本文從分離自內(nèi)蒙古地區(qū)傳統(tǒng)乳制品的乳酸菌中篩選出一株廣譜抗菌活性瑞士乳桿菌AJT，對其抗菌物質(zhì)特性進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

瑞士乳桿菌AJT 分離自內(nèi)蒙古地區(qū)傳統(tǒng)乳制品;指示菌 為實驗室保藏菌株(見表3);脫脂乳培養(yǎng)基、MRS 液體培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、PDA 培養(yǎng)基 根據(jù)文獻(xiàn)［12］方法配制;0.45、0.22μm 微孔濾膜 購自天津東康科技有限公司;胃蛋白酶 購自SIGMA-ALDRICH 公司;胰蛋白酶 購自AMRESCO公司;木瓜蛋白酶(德國進(jìn)口分裝) 購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;蛋白酶K 購自上海江萊生物科技有限公司;過氧化氫酶 購自西安國安生物科技有限公司。

超凈工作臺ZHJH-C1214C 南京依貝儀器設(shè)備有限公司;立式壓力滅菌器YXQ-LS-30 SII 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;pH 計PB-10 Sartorius 集團(tuán);電熱恒溫培養(yǎng)箱DHP-9082 上海一恒科技有限公司;恒溫水浴鍋JC-HH-S26濟(jì)南精誠實驗儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 發(fā)酵液的制備 將真空干燥保存的菌株AJT于脫脂乳培養(yǎng)基中活化1～2 代，接種于MRS 液體培養(yǎng)基，活化3 代。按2%體積比接種于50mL MRS 液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h，8000r/min 離心10min，取上清液0.45μm 濾菌器過濾除菌，冷藏備用。

1.2.2 指示菌的培養(yǎng) 將大腸桿菌等細(xì)菌用營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基37℃培養(yǎng);真菌用PDA 斜面培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 菌株AJT 抗菌活性測定 將菌株AJT 按體積比例2%接種于MRS 液體培養(yǎng)基中，每隔2h 測其OD600nm及pH，將菌液8000r/min 離心10min，0.22μm濾菌器濾菌后以大腸桿菌ACCC 10145 做指示菌，通過牛津杯法測定其抗菌活性，實驗進(jìn)行三個平行。

1.2.4 抗菌物質(zhì)的提取 根據(jù)抗菌物質(zhì)產(chǎn)生情況，取抗菌物質(zhì)活性最佳時的發(fā)酵上清液200mL，60℃濃縮至50mL 左右，用乙酸乙酯萃取搖瓶過夜，靜置6h 后取上層低溫干燥，沉淀用甲醇抽提［13］2 次，8000r/min 離心10min，上清液經(jīng)真空低溫干燥，得到的沉淀用滅菌蒸餾水溶解后即為抗菌物質(zhì)提取液，將其4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 酸抑制作用的排除 乳酸菌在代謝過程中能產(chǎn)生多種具有抑菌活性的產(chǎn)物，包括酸性物質(zhì)、CO2、H2O2、細(xì)菌素及類細(xì)菌素等［14］。為排除酸性末端產(chǎn)物的干擾，用2mol/L NaOH 將抗菌物質(zhì)提取液pH 調(diào)節(jié)為5.0，以乳酸和乙酸調(diào)節(jié)pH 至5.0 的滅菌蒸餾水作對照，進(jìn)行牛津杯法抑菌實驗。

1.2.6 過氧化氫干擾的排除 乳酸菌代謝產(chǎn)生的過氧化氫也可抑制細(xì)菌的生長，尤其是抑制革蘭氏陰性菌的生長［15］。取1mL 抗菌物質(zhì)提取液，加入過氧化氫酶，使其終濃度達(dá)1mg/mL，以未經(jīng)過氧化氫酶處理的抗菌物質(zhì)提取液作為對照，37℃水育24h，以大腸桿菌做指示菌，測定抗菌活性。

1.2.7 抗菌物質(zhì)的熱穩(wěn)定性 將抗菌物質(zhì)提取液分別在-37、-20、37、60、90、100、121℃條件下處理30min，以4℃保存的提取液作對照，進(jìn)行牛津杯抑菌實驗，比較抑菌活性強(qiáng)弱。

1.2.8 抗菌物質(zhì)的pH 穩(wěn)定性 取等量的菌株AJT的抗菌物質(zhì)提取液，用1mol/L HCl 和2mol/L NaOH分別調(diào)節(jié)pH 至2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，以未處理的提取液作為對照，測定抑菌活性。

1.2.9 抗菌物質(zhì)的蛋白酶敏感性 取4 份抗菌物質(zhì)提取液，用1mol/L HCl 和2mol/L NaOH 分別調(diào)節(jié)至胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K 和木瓜蛋白酶的最適pH(依次為7.4、2.0、7.4 和6.0)，按終濃度1.0mg/mL加入各酶液，37℃反應(yīng)2h 后，沸水處理5min。將pH調(diào)回到原始值，以未處理的提取液作對照，進(jìn)行抑菌實驗。

1.2.10 抗菌物質(zhì)的紫外線敏感性 取4 份等量抗菌物質(zhì)提取液，0.22μm 濾菌器濾菌，取三份提取液平鋪于滅菌平皿，于40W 紫外燈下分別輻照10、30、120min，另外一份作為對照，測定抑菌活性。

1.2.11 抗菌物質(zhì)的抑菌譜 用不同的革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、真菌做指示菌，進(jìn)行牛津杯擴(kuò)散抑菌實驗，每支牛津杯加入200μL 抗菌物質(zhì)提取液［16］。

1.2.12 數(shù)據(jù)處理 用軟件DPS v6.55 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株AJT 抗菌活性測定

將瑞士乳桿菌AJT 按2% 體積比接種于起始pH6.5 的MRS 液體培養(yǎng)基，置37℃培養(yǎng)60h 的生長曲線及抑菌活性曲線見圖1。由圖1 可知，菌株AJT培養(yǎng)至2h 即進(jìn)入對數(shù)生長期，12h 左右進(jìn)入穩(wěn)定期;pH 于培養(yǎng)4h 顯著下降，16h 后趨于穩(wěn)定，從整個發(fā)酵過程可以看出菌株AJT 產(chǎn)酸能力較強(qiáng)，最終pH 穩(wěn)定在3.8 左右。從對數(shù)期前期(6h)開始，菌株AJT 具有抗菌活性，這與瑞士乳桿菌G51 類似［17］。進(jìn)入穩(wěn)定期(12h)后抗菌物質(zhì)產(chǎn)量持續(xù)增加，穩(wěn)定期中期(20h)抗菌物質(zhì)活性達(dá)到最高水平，之后抑菌活性稍微有所下降，故后期抗菌物質(zhì)研究中以發(fā)酵20h 的發(fā)酵液為研究對象，這一特性與短乳桿菌FPTLB3 所產(chǎn)抗菌物質(zhì)特性類似，菌株FPTLB3 抑菌活性在19h時達(dá)到最大值［18］。

圖1 菌株AJT 生長曲線及抑菌活性測定Fig.1 Production profile of the active antimicrobial substance produced by Lactobacillus helveticus AJT

2.2 酸抑制作用的排除

乳酸菌在代謝過程中可能會產(chǎn)生酸性抑菌物質(zhì)，如乳酸、乙酸和其他有機(jī)酸類，為排除酸性末端產(chǎn)物干擾，將菌株AJT 的抗菌物質(zhì)提取液pH 調(diào)節(jié)至5.0，與乳酸和乙酸調(diào)節(jié)pH 至5.0 的滅菌蒸餾水對比，以大腸桿菌做指示菌，進(jìn)行抑菌實驗。結(jié)果如表1 所示，pH5.0 的抗菌物質(zhì)提取液抑菌活性依然很強(qiáng)，而pH5.0 的乳酸、乙酸不顯示抑菌活性。故菌株AJT 的抗菌物質(zhì)提取液排除酸性末端產(chǎn)物的干擾后，仍存在其他的抑菌活性物質(zhì)。

2.3 過氧化氫作用的排除

乳酸菌在代謝過程中可能產(chǎn)生過氧化氫，也能抑制其他細(xì)菌的生長，故應(yīng)排除過氧化氫的干擾。設(shè)置對照組的排除過氧化氫實驗結(jié)果見圖2，用過氧化氫酶處理的抗菌物質(zhì)提取液與對照組的抑菌圈直徑大小接近，故排除抗菌活性由過氧化氫所致。

表1 酸抑制作用的排除Table 1 Eliminate the effect of organic acids

圖2 過氧化氫作用的排除Fig.2 Eliminate the effect of hydrogen peroxide

2.4 抗菌物質(zhì)的熱穩(wěn)定性

將等量抗菌物質(zhì)提取液在不同的溫度下處理30min，以4℃保存的提取液做對照，抑菌實驗結(jié)果見圖3，經(jīng)不同溫度處理后的樣品抑菌圈直徑大小無顯著差異，說明菌株AJT 所產(chǎn)抗菌物質(zhì)具有熱穩(wěn)定性。

圖3 不同溫度對抗菌物質(zhì)的影響Fig.3 Effect of temperature on the inhibitory activity of antibacterial substance

2.5 抗菌物質(zhì)的pH 穩(wěn)定性

分別調(diào)節(jié)至不同pH 的抗菌物質(zhì)水溶液和未經(jīng)處理的抗菌物質(zhì)水溶液的抑菌實驗，結(jié)果如圖4 所示，抗菌物質(zhì)的有效抑菌pH 范圍為2.0～5.0，在pH2.0 時，抑菌圈直徑最大，隨著pH 增大，抑菌圈直徑逐漸下降，至pH6.0 時完全失去抑菌活性。由于原始提取液的pH 為3.04，所以對照的抑菌圈直徑與調(diào)節(jié)pH 至3.0的樣品的抑菌圈直徑大小相當(dāng)。

2.6 抗菌物質(zhì)的蛋白酶穩(wěn)定性

圖4 pH 對抗菌物質(zhì)活性的影響Fig.4 Effect of pH on the inhibitory activity of antibacterial substance

將抗菌物質(zhì)水溶液經(jīng)不同蛋白酶處理后滅酶，然后進(jìn)行牛津杯擴(kuò)散抑菌實驗，結(jié)果如圖5 所示。與對照比較，經(jīng)蛋白酶處理后的抗菌物質(zhì)的抑菌活力均顯著下降，但仍然具有很強(qiáng)的抑菌活性，表明該提取液中抗菌物質(zhì)為蛋白類或非單一抗菌物質(zhì)組成，具體成分有待進(jìn)一步分析確定。

圖5 抗菌物質(zhì)的蛋白酶敏感性Fig.5 Inhibitory activities of antimicrobial substance after being treated by protease

2.7 抗菌物質(zhì)的紫外線敏感性

在40W 紫外燈下輻照10、30、120min 的抗菌物質(zhì)水溶液及未處理樣品的抑菌活性見表2，經(jīng)紫外線輻照不同時間的抗菌物質(zhì)提取液抗菌活性與對照的抗菌活性無顯著差異，說明菌株AJT 所產(chǎn)抗菌物質(zhì)對紫外線不敏感。

表2 抗菌物質(zhì)的紫外線敏感性Table 2 Inhibitory activities of antimicrobial substance after being treated by UV

2.8 抗菌物質(zhì)的抑菌譜

通過以不同的革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌及真菌做指示菌，進(jìn)行牛津杯擴(kuò)散抑菌實驗，得到菌株AJT 所產(chǎn)抗菌物質(zhì)的抑菌譜，見表3:

由表3 可以得出，菌株AJT 產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)對所選的指示菌均顯示了抗菌活性，其中對大腸桿菌、蠟狀芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、少孢根霉顯示了很強(qiáng)的抗菌活性，抑菌圈直徑30mm 以上;對金黃色葡萄球菌、熒光假單胞桿菌、擴(kuò)展青霉、煙曲霉、黃色鐮刀菌顯示了較強(qiáng)的抗菌活性，抑菌圈直徑20mm 以上;但其對米曲霉的抗菌活性較弱。瑞士乳桿菌AJT 產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)的抑菌譜，與已報道的類細(xì)菌素的抗菌譜類似，如嗜酸乳桿菌產(chǎn)生的類細(xì)菌素Lactobacillin NX2-6，也對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和真菌具有較強(qiáng)的抑制作用［19］;乳酸菌SD-22 產(chǎn)生的類細(xì)菌素Lactobacillus SD-22，對革蘭氏細(xì)菌及部分真菌有明顯的抑制作用［15］。由于細(xì)菌素的定義存在多種說法，對類細(xì)菌素的歸屬也缺乏一個統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)［20］。根據(jù)目前已報道的細(xì)菌素和類細(xì)菌素的特性區(qū)別，基于瑞士乳桿菌AJT 所產(chǎn)抗菌物質(zhì)的抗菌譜及熱穩(wěn)定等特性，初步將菌株AJT 產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)歸為類細(xì)菌素。

表3 菌株AJT 抗菌物質(zhì)的抑菌譜Table 3 Antimicrobial spectrum of Lactobacillus helveticus AJT

3 結(jié)論

從內(nèi)蒙古地區(qū)傳統(tǒng)乳制品中分離到的廣譜抗菌活性瑞士乳桿菌AJT，其產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)排除酸和過氧化氫的抗菌作用后，對熱穩(wěn)定，在pH2.0～5.0 有較強(qiáng)活性，對胃蛋白酶等蛋白酶敏感，對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、真菌均具有抗菌活性。尤其對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等常見致病細(xì)菌和少孢根霉、擴(kuò)展青霉等真菌具有明顯的抑制作用，因此，其在食品保藏及農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)等方面具有潛在應(yīng)用能力。

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