羥自由基氧化系統(tǒng)對體外模擬體系中NDMA 合成反應(yīng)的影響

黃宗海，孟培培，孫衛(wèi)青，朱迎春，楊 華，王 瑞，馬儷珍

(1.天津農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)系，天津300384;2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西太谷030801;3.長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北荊州434023;4.天津農(nóng)學(xué)院農(nóng)業(yè)分析中心實(shí)驗(yàn)室，天津300384;5.天津市農(nóng)副產(chǎn)品深加工技術(shù)工程中心，天津300384)

在肉品加工中，發(fā)色劑亞硝酸鹽在一定條件下與胺類物質(zhì)反應(yīng)會(huì)產(chǎn)生亞硝胺。亞硝胺是毒性和危害作用很強(qiáng)的一類化合物［1-2］，所以了解亞硝胺形成的主要影響因素及作用方式并能有效地抑制，是肉類制品質(zhì)量安全研究的重要課題之一。影響各種亞硝胺形成的因素是多方面的，包括肉基質(zhì)環(huán)境的氧化還原電位、底物濃度、pH、溫度、離子強(qiáng)度等［3］。其中最主要的是內(nèi)環(huán)境中的氧化體系。亞硝酸鹽作為食品添加劑加入后，存在于肉這個(gè)復(fù)雜的氧化體系中，參與其中的反應(yīng)。氧分子通過一個(gè)電子的減少，產(chǎn)生超氧陰離子自由基、氫過氧自由基、過氧化氫、羥自由基等，直接或間接參與肉和肉制品的氧化過程［4］。H2O2激活的高鐵肌紅蛋白和血紅蛋白可以氧化一系列的化合物，并導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚合［5］。肌紅蛋白和血紅蛋白中的Fe2+、Fe3+被H2O2激活，形成一種非常短暫的Fe4+或酮基鐵自由基［6］。在羥自由基氧化系統(tǒng)中，F(xiàn)e3+和抗壞血酸(Asc)反應(yīng)形成Fe2+，之后再和H2O2反應(yīng)形成羥自由基，具有強(qiáng)氧化性。由于Asc 的存在，F(xiàn)e3+不斷被還原，使反應(yīng)持續(xù)進(jìn)行［7］。由于肉品中這些氧化體系的存在，可能會(huì)影響到其中亞硝胺的生成。但是，這個(gè)氧化系統(tǒng)是如何影響亞硝胺生成的，在所能檢索到的國內(nèi)外文獻(xiàn)范圍內(nèi)未見報(bào)道。本研究設(shè)計(jì)羥自由基氧化系統(tǒng)，研究氧化體系的條件改變對二甲基亞硝胺(N -Nitrosodimethylamine，NDMA)形成的影響情況。本文主要研究不同條件的羥自由基氧化系統(tǒng)中，亞硝酸鹽和二甲胺(Dimethylamine，DMA)反應(yīng)生成NDMA的反應(yīng)情況。實(shí)驗(yàn)以二甲胺和亞硝酸鈉(NaNO2)為反應(yīng)底物，考察H2O2濃度、FeCl3濃度、反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)溫度對NDMA 生成量的影響，為進(jìn)一步研究肉品氧化體系中脂肪氧化、蛋白氧化與亞硝胺形成之間的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

磷酸氫二鈉、檸檬酸、二氯甲烷 天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠;亞硝酸鈉(NaNO2)、二甲胺鹽酸鹽(DMA)、FeCl3、抗壞血酸(ascorbic acid，Asc) 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;H2O2天津市江天化工技術(shù)有限公司;氨基磺酸銨 天津基準(zhǔn)化學(xué)試劑有限公司;丁基羥基茴香醚(BHA)、乙二胺四乙酸(EDTA) Sigma 試劑公司;Trolox 東京化成工業(yè)株式會(huì)社;硫酸 固安縣清遠(yuǎn)化工廠，以上試劑均為分析純;配制溶液用水均為超純水。

GC/MS 氣相色譜- 質(zhì)譜聯(lián)用儀(Agilent GC7890A/MSD5975C，配7693 自動(dòng)進(jìn)樣器) 美國Agilent 公司;UPW-50S 型超純水機(jī) 北京市歷元電子儀器技貿(mào)公司;KQ-500DE 型數(shù)控超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司;PB-10 酸度計(jì)Sartorius;HH 數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇金壇市金城國勝實(shí)驗(yàn)儀器廠;LAB DANCER S25 漩渦混合器IKA。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 體外模擬反應(yīng)系統(tǒng)的制備 在15mL 的緩沖液(內(nèi)含50mmol/L 磷酸氫二鈉-25mmol/L 檸檬酸的緩沖液，pH3.3)中依次加入8mmol/L NaNO2和DMA(最終濃度)和不同濃度的氧化體系(FeCl3/Asc/H2O2)［8-9］，最后用緩沖液定容至25mL，搖勻后傾入100mL 帶蓋離心管內(nèi)，放入恒溫水浴中進(jìn)行加熱反應(yīng)(按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)反應(yīng)的溫度和時(shí)間)，反應(yīng)結(jié)束后取出、冷卻、轉(zhuǎn)移到分液漏斗中，立即加入1mmol/L BHA/Trolox/EDTA(三者最終濃度均為1mmol/L，目的是終止氧化反應(yīng)［10］)和3mL 100mmol 氨基磺酸銨溶液和1mL 硫酸溶液(1∶3)(目的是終止NaNO2和DMA 之間的亞硝化反應(yīng)［11］)。最后，在分液漏斗中加入10mL 二氯甲烷(分兩次萃取)，反復(fù)振搖以萃取其中的NDMA，將從分液漏斗收集的2 次二氯甲烷混勻，并用硫酸鈉干燥除去其中混有的少量水分，過濾除去硫酸鈉，用二氯甲烷沖洗硫酸鈉，將沖洗液與二氯甲烷萃取液混合后定容至10mL 容量瓶中。用氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)聯(lián)用儀測定其中NDMA 含量。色譜圖見圖1 所示。

圖1 NDMA 標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖Fig.1 The GC chromatogram of NDMA standard

1.2.2 過氧化氫/鐵/抗壞血酸(H2O2/Fe/Asc)氧化反應(yīng)系統(tǒng)的制備 該系統(tǒng)可以產(chǎn)生活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)，為羥基自由基(·OH)產(chǎn)生的氧化系統(tǒng)(hydroxyl radical-generating system，HRGS)，主要由FeCl3、Asc 和H2O2通過鐵離子的氧化還原反應(yīng)而產(chǎn)生。FeCl3、Asc 和H2O2的具體濃度詳見表1 所示。

1.2.3 色譜條件 色譜柱:DB-WAX 毛細(xì)管色譜柱(30m ×250μm ×0.25μm)，美國Agilent 公司;升溫程序:初始50℃，保持4min，以10℃· min-1升至120℃，保持7min，后運(yùn)行180℃，3min;進(jìn)樣口溫度:250℃;載氣:He;流速:1.1971mL·min-1;進(jìn)樣模式:不分流進(jìn)樣;進(jìn)樣量:1μL。

1.2.4 質(zhì)譜條件 離子源溫度:230℃;四級桿溫度:150℃;接口溫度:250℃;電離方式:電子轟擊離子源;電子能量:70eV;電子倍增器電壓:1253V;質(zhì)量數(shù)掃描范圍:30～150;溶劑延遲:8min;閾值:0;特征碎片峰:42、43;定量離子:74。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

本實(shí)驗(yàn)按照以下6 個(gè)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行設(shè)計(jì)，同時(shí)做試劑空白，詳見表1 所示。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，結(jié)果取平均值。數(shù)據(jù)采用Statistix8.1 軟件包中Linear Models 程序進(jìn)行，差異顯著性(p ＜0.05)分析使用Tukey HSD 程序。繪圖軟件采用SigmaPlot 9.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同F(xiàn)eCl3 濃度下，H2O2 濃度變化對NDMA合成的影響

不同F(xiàn)eCl3濃度下，隨著H2O2濃度的變化，NDMA 含量變化情況見圖2。

表1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案Table 1 The design of the experiment

圖2 不同F(xiàn)eCl3 濃度下，H2O2 對NDMA 生成量的影響Fig.2 The content of NDMA changes with the H2O2concentration on the FeCl3concentration

由圖2 可以看出，體系中四種不同F(xiàn)eCl3濃度下，NDMA 的生成量均隨著H2O2濃度的增大而迅速減小，H2O2濃度為0mmol/L 時(shí)，NDMA 含量為3.3μg/mL，當(dāng)H2O2濃度升高至5mmol/L 時(shí)，NDMA的量已經(jīng)降為0.2μg/mL，下降了93.9%，之后隨著H2O2濃度的增大，NDMA 的生成量趨于平穩(wěn)，變化不顯著。不同處理組之間，在H2O2濃度較低時(shí)(＜2.5mmol/L)，NDMA 的生成量在不同F(xiàn)eCl3濃度下組間差異顯著(p ＜0.05)，在H2O2濃度低于2.5mmol/L時(shí)，不同F(xiàn)eCl3濃度的處理組之間，NDMA 生成量組間差異顯著(p ＜0.05)，且并非FeCl3濃度越高，NDMA 生成量越少;當(dāng)H2O2濃度大于2.5mmol/L 時(shí)，NDMA 生成量組間差異不顯著(p ＞0.05);當(dāng)H2O2濃度大于5mmol/L 時(shí)，F(xiàn)eCl3濃度變化對NDMA 生成量影響不大。

2.2 不同H2O2 濃度的羥自由基氧化體系中，NDMA 合成量隨反應(yīng)時(shí)間變化的變化情況

FeCl3濃度固定(0.4mmol/L)，H2O2濃度分別為0.1、1、2mmol/L 時(shí)，氧化反應(yīng)體系中NDMA 生成量隨時(shí)間變化的結(jié)果見圖3。

圖3 不同H2O2 濃度隨反應(yīng)時(shí)間變化對NDMA 生成量的影響Fig.3 The content of NDMA changes with the time on the H2O2concentration

由圖3 可以看出，隨著氧化反應(yīng)時(shí)間的延長，NDMA 生成量均呈增加的趨勢，但增加的幅度不同。反應(yīng)開始后1～2h，不同H2O2濃度下，NDMA 生成的速度基本相同;2h 以后出現(xiàn)顯著變化，H2O2濃度越低，NDMA 生成量越大，且NDMA 合成速度也明顯增加。H2O2濃度越大，NDMA 生成量越少，三者差異達(dá)顯著水平(p ＜0.05)。5h 時(shí)，2mmol/L H2O2的NDMA生成量是0.1mmol/L H2O2時(shí)的一半，且H2O2濃度為2mmol/L 時(shí)，體系中NDMA 的生成量隨反應(yīng)時(shí)間延長增加的趨勢逐漸減緩，同時(shí)NDMA 生成量明顯降低。

2.3 不同F(xiàn)eCl3 濃度的羥自由基反應(yīng)體系中，NDMA 生成量隨反應(yīng)時(shí)間的變化

H2O2濃度固定，F(xiàn)eCl3的量分別為0.1、0.4、1.0mmol/L 時(shí)，氧化反應(yīng)體系中NDMA 生成量隨時(shí)間變化的結(jié)果如圖4 所示。

由圖4 可以看出，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，體系中NDMA 的生成量均呈顯著增加趨勢。但是不同的FeCl3濃度處理之間，NDMA 的變化情況組間差異不顯著。

圖4 不同F(xiàn)eCl3 濃度隨反應(yīng)溫度變化對NDMA 生成量的影響Fig.4 The content of NDMA changes with the temperature on the FeCl3 concentration

圖2 ～圖4 結(jié)果顯示，在固定FeCl3濃度下，NDMA 的合成量隨H2O2濃度的升高而降低，可能是因?yàn)檠趸w系不斷地將HNO2氧化為NO3-，使HNO2的濃度大大下降，亞硝化底物的減少使得NDMA 的生成量逐漸降低。與假設(shè)結(jié)果不同的是，隨著氧化體系中FeCl3濃度的增加，NDMA 的合成量并非一直下降。在H2O2濃度低于2.5mmol/L 時(shí)，氧化體系中含0.1mmol/L FeCl3反而比0.025 mmol/L 的FeCl3使得NDMA 的生成量還要高。產(chǎn)生這種結(jié)果的原因一方面可能是鐵在這個(gè)氧化體系中可能會(huì)發(fā)生水解反應(yīng)(Fe3++3H2O ≒Fe(OH)3+3H+)，水解產(chǎn)生H+對亞硝胺的形成有利。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［12-14］，亞硝酸鈉和二甲胺的反應(yīng)過程可以表示為:

亞硝酸鈉和二甲胺的化學(xué)計(jì)量系數(shù)比為1∶1，并且反應(yīng)需在酸性條件下進(jìn)行。另一方面，F(xiàn)e3+和Fe2+的濃度比直接影響到反應(yīng)的移動(dòng)，從而可能改變反應(yīng)的方向，這可能也會(huì)造成氧化體系中Fe3+濃度增加，從而Fe3+氧化NO2-，使NO2-減少，抑制NDMA 的形成。反而對NDMA 形成的抑制作用減弱的其中一個(gè)主要原因。

2.4 不同H2O2 濃度的羥自由基反應(yīng)體系中，溫度變化對NDMA 生成量的影響

不同H2O2濃度的羥自由基反應(yīng)體系中，溫度變化對NDMA 生成量的影響結(jié)果見圖5。

圖5 不同H2O2 濃度隨反應(yīng)溫度變化對NDMA 生成量的影響Fig.5 The content of NDMA changes with the temperature on the H2O2 concentration

圖5 顯示，模擬反應(yīng)體系中，當(dāng)氧化體系中反應(yīng)溫度低于40℃時(shí)，NDMA 生成量沒有明顯變化，而且三個(gè)不同H2O2濃度之間的NDMA 生成量差異不顯著(p ＞0.05)。當(dāng)反應(yīng)溫度高于40℃時(shí)，模擬反應(yīng)體系中三條曲線的變化趨勢均明顯增大。特別是達(dá)到80℃時(shí)，不同H2O2濃度之間，0.1mmol/L 的H2O2氧化體系中，NDMA 生成量的極顯著增加。隨H2O2濃度增大，相同溫度下NDMA 的生成量明顯下降，而且溫度越高下降的幅度越大。

2.5 不同F(xiàn)eCl3 濃度的羥自由基反應(yīng)體系中，NDMA 生成量隨反應(yīng)溫度的變化

不同F(xiàn)eCl3濃度的羥自由基反應(yīng)體系中，NDMA生成量隨反應(yīng)溫度的變化結(jié)果見圖6。

圖6 不同F(xiàn)eCl3 濃度隨反應(yīng)溫度變化對NDMA 生成量的影響Fig.6 The content of NDMA changes with the temperature on the FeCl3 concentration

圖6 表明，當(dāng)反應(yīng)溫度低于40℃時(shí)，不同F(xiàn)eCl3濃度下，NDMA 的生成量變化不顯著，高于40℃時(shí)NDMA 的生成量逐漸增加，溫度達(dá)到80℃時(shí)，含0.4mmol/L 的FeCl3氧化體系處理組NDMA 的生成量極顯著增加，含0.1mmol/L 和1.0mmol/L 的FeCl3氧化體系處理組，組間差異不顯著(p ＞0.05)。

圖5、圖6 結(jié)果表明，NDMA 均是在溫度高于40℃才可以形成，而且NDMA 的形成與溫度呈明顯的正相關(guān)關(guān)系。溫度每升高10℃，NDMA 的生成量僅大約增加0.5～1 倍。依據(jù)范霍夫近似規(guī)則［15］，一般情況下溫度每升高10℃，反應(yīng)速率大約增加2～4倍。可見過氧化氫/鐵/抗壞血酸氧化系統(tǒng)確實(shí)能夠抑制NDMA 的生成。

本體外模擬實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，在肉品體系中如果發(fā)生過度氧化，產(chǎn)生過量的自由基，則肉品基質(zhì)中的亞硝酸鹽也可能會(huì)被氧化，從而亞硝胺的生成量減少。但肉品體系復(fù)雜，基質(zhì)中可能存在各種抗氧化和氧化成分，這可能是肉品中添加抗氧化劑對亞硝胺的抑制作用強(qiáng)弱不同［16-22］的主要原因。

3 結(jié)論

亞硝酸鈉(NaNO2)和二甲胺(DMA)的反應(yīng)體系中加入H2O2/FeCl3/Asc 氧化系統(tǒng)可以抑制NDMA 的生成。其中H2O2濃度變化對NDMA 的生成有顯著的影響，隨著H2O2濃度的增加，NDMA 的生成量逐漸降低，H2O2濃度為5mmol/L 時(shí)對NDMA 的抑制率可達(dá)97.5%。適當(dāng)增加FeCl3的濃度，也可抑制NDMA 的生成。隨著氧化反應(yīng)時(shí)間的延長，NDMA生成量呈明顯的增加趨勢。反應(yīng)溫度低于40℃時(shí)NDMA 生成量沒有明顯變化，且氧化體系中H2O2和FeCl3的濃度對NDMA 的生成量沒有顯著影響，高于60℃時(shí)NDMA 生成量開始顯著增加。80℃時(shí)氧化體系中H2O2和FeCl3的濃度的變化對NDMA 的生成量影響極顯著。

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